抗兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及抗兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）ＶＰ６０蛋白单克隆抗体，属于生物技术领域。取ＳＰ２／０骨髓瘤细胞与用ＲＨＤＶ重组ＶＰ６０蛋白免疫的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞进行细胞融合，用ＨＡＴ培养基进行选择性培养后，用重组ＶＰ６０蛋白和ＲＨＤＶ进行双重ＥＬＩＳＡ筛选，分别对细胞培养上清进行检测、筛选获得稳定分泌抗ＲＨＤＶ　ＶＰ６０蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株Ａ３Ｃ，测得Ａ３Ｃ腹水ＥＬＩＳＡ效价为１∶３２７６００，经鉴定该单克隆抗体既可与表达的重组ＶＰ６０蛋白特异性结合，又可与ＲＨＤＶ特异性结合，均出现单一一条反应条带，证明抗ＲＨＤＶ　ＶＰ６０蛋白单克隆抗体是ＲＨＤＶ衣壳蛋白ＶＰ６０特异性抗体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗兔出血症病毒(RHDV) VP60蛋白单克隆抗体，属于生物
，涉 及抗体工程技术，具体为抗兔出血症病毒(RHDV) VP60蛋白单克隆抗体。
技术介绍
兔出血症(RHD)，又称兔瘟，是由兔出血症病毒(RHDV)引起的一种以急性、高度 传染性、大面积死亡为特征的兔传染病，感染兔通常48 72 h死亡，主要特征为传染性 极强、呼吸系统出血、肝坏死、脏器水肿、淤血和出血等变化，给全世界养兔业造成了 巨大的经济损失。国际兽医局将该病列为B类传染病，我国农业部96号令颁布为二类疫 病。朋DV属杯状病毒，病毒粒子呈球型，为二十面体对称，无囊膜。病毒含有一条单股 正链RNA，由7437个核苷酸组成，与一般的杯状病毒不同，RHDV只有2个开放阅读框架 (ORF) ， ORFI位于基因组5'端，从核苷酸10延伸至核苷酸7041，约占整个基因组的94%。 朋DV的ORFI基因序列为NH2-P16-P23-2C解旋酶-P30-VPg-3C样蛋白酶-3D聚合酶-衣 壳蛋白-COOH。衣壳蛋白是RHDV唯一的结构蛋白，称为VP60，其基因片段长度为1 740 bp， 共编码580个氨基酸，与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关。用纯化的RHDV病毒作为 免疫原制备单克隆抗体的效价通常偏低，不利于RHDV单克隆抗体的应用。利用杆状病毒 表达系统表达的RHDV VP60重组蛋白制备的单克隆抗体可为VP60蛋白研究和RHDV免疫 学方法建立提供必要的试剂和技术手段，对探索VP60蛋白的生物学功能区域和建立RHDV 特异、敏感的检测方法等具有重要意义。
技术实现思路
技术问题 本专利技术的目的是提供抗兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体。本专利技术 的单克隆抗体是用杆状病毒表达系统表达的重组VP60蛋白为抗原，免疫BALB/c小鼠， 利用杂交瘤技术制备获得的，能特异识别RHDV衣壳蛋白。兔出血症病毒重组VP60蛋白 是将RHDV VP60基因克隆于杆状病毒表达系统的穿梭载体并通过转染在昆虫细胞中表达 的蛋白。技术方案一种抗兔出血症病毒RHDV衣壳蛋白VP60单克隆抗体，其特征在于该单克隆 抗体是杂交瘤细胞株A3C产生的，杂交瘤细胞株A3C于2009年3月24日宝藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC一C200921。制备方法包括1) RHDV重组VP60蛋白的制备根据RHDV VP60序列设计一对引物，用RT-PCR方 法扩增RHDV衣壳蛋白VP60基因，通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bacmid-VP60，用此质粒转染Sf9昆虫细胞，得到重组病毒rAcV-Bac-VP60，用此重组病毒感染Sf9昆虫 细胞，经免疫荧光法、Western-blotting、血凝实验鉴定重组VP60蛋白表达，获得免疫 用重组VP60蛋白；2) 小鼠免疫用血凝效价为13 kg 2的RHDV重组VP60蛋白免疫6 8周龄的雌性 BALB/c小鼠，免疫程序为皮下注射弗氏完全佐剂乳化的抗原200iiL/只，2周后皮下 注射弗氏不完全佐剂乳化的等量抗原，间隔2周后，再皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的 等量抗原，融合前3天腹腔注射等量不加佐剂的抗原加强免疫；3) 细胞融合取SP2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按l : 5 1 : 10的比例混合于50 mL离心管中，充分混匀，l,OOOrpm离心10min，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散 均匀，置40。C水浴预热，用lmL吸管在45s内加完预热至4(TC的50。/。PEG-4000 1mL，边 加边轻轻振荡，然后在90s内加入30mL预热至37'C的DMEM不完全培养基，室温静置 10min， 1,000rpm离心10min，弃上清，加入20mL含20^FCS和HAT的DMEM培养基重悬。 分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5。/。C02培养箱培养，7d后，观察细胞的生长状况， 用含有20Q/。FCS和HT的DMEM培养基换出l/2培养基；14d后，改用含20。/。FCS和HT的 DMEM培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的l/5时，取上清进行抗体检测；4) 杂交瘤筛选用包被液为0. 05 mol/L pH 9. 6碳酸盐缓冲液对起始血凝效价为13 bg 2的兔出血 症肝病料上清液和杆状病毒表达系统表达的血凝效价为13 log 2VP60蛋白进行倍比稀释， 用稀释至l: 27的液体包被ELISA板，100yL/孔，置4。C包被过夜；PBST洗涤3次，每 次5min，最后一次拍干；以2%明胶封闭每孔，200uL/孔，37'C放置2h; PBST洗漆3 次，每次5min，最后一次拍干；将细胞上清、1 : IOO稀释的阳性参考血清和1 : 100稀 释的阴性参考血清，加入相应孔内，100uL/孔，37。C作用90 min; PBST洗涤3次，每 次5min，最后一次拍干；加入1 : 2000稀释的酶标羊抗鼠IgG， 100uL/孔，37'C放置 60min; PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB- H202， 100uL/孔， 室温避光显色10min;每孔加入50uL 2 mol/L硫酸终止反应；经酶标仪测定0D450nm 值以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的0D45。值，当阴性参考血清 的OD柳值^0.1，阳性参考血清的OD柳值与阴性参考血清的OD45o值的比值^2.1，即阴、 阳性对照成立的前提下，P/N^2.1的检测孔判为阳性，1. 5《P/N<2.1的检测孔判为可 疑，P/N<1. 5的检测孔判为阴性；5) 有限稀释法对杂交瘤细胞亚克隆首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用DMEM完全培养基稀释成100 个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL， 37'C， 5 。/。C02培养箱中培养，4 5d后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个 克隆生长孔，8 9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测；选择阳性的单克隆细胞再进 行同样的亚克隆3次以上，直至亚克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性、且各孔检测OD 值较接近；将多次亚克隆培养后的阳性孔细胞扩大培养，并冻存，获得稳定分泌抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株A3C;6)抗RHDVVP60蛋白单克隆抗体的制备将石蜡油注射成年BALB/c小鼠，0. 5 mL /只，致敏7天后，将阳性杂交瘤细胞株 A3C用0.01MPBS稀释后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射5xlC^ lxl(^个细胞，0.2mL， 5 IO天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，11000g，离心5min，收集上清，小量分装，-70 'C保存。有益效果本专利技术的特点和优点如下1、 本专利技术提供的RHDV重组蛋白VP60抗原制备方法简便可行；2、 本专利技术提供的抗RHDV衣壳蛋白VP60的单克隆抗体特异性强，制备方法简单；3、 本专利技术提供的特异性单克隆抗体可用于VP60蛋白的研究和RHDV免疫学检测方 法的建立。4、 获得稳定分泌抗RHDVVP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株A3C，测得A3C腹 水ELISA效价为1:327600，经鉴定该单克隆抗体既可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗兔出血症病毒ＲＨＤＶ衣壳蛋白ＶＰ６０单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体是杂交瘤细胞株Ａ３Ｃ产生的，杂交瘤细胞株Ａ３Ｃ于２００９年３月２４日宝藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００９２１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王芳，范志宇，胡波，蔡少平，徐为中，张则斌，何孔旺，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]