本发明专利技术公开了一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂在培育克隆胚胎或转基因胚胎中的应用。所述培育克隆胚胎或转基因克隆胚胎，包括如下步骤：1)将离体的供体细胞与离体的去核卵融合得到重构胚；2)将所述重构胚进行体外激活，所述方法还包括步骤1)和步骤2)之间的TSA处理，所述TSA处理包括以下步骤：将所述步骤1)的重构胚移入含组蛋白去乙酰化酶抑制剂的胚胎培养液中培养1-6小时。实验证明：TSA处理激活前的重构胚可使染色体保持完整性，保证了移入核的遗传物质的完整性，并且TSA处理后，胚胎发育质量得到提高(7天囊胚细胞数从87.6提高到111.3)。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及组蛋白去乙酰化酶抑制剂在培育转基因胚胎中的应用。
技术介绍
在常规克隆操作过程中，在重构卵融合之后，将其转移到培养液中，在37℃，5％CO2条件下培养1至数小时不等。在此期间没有TSA的参与。然后，再进行激活处理。在这种操作条件下，重构胚的染色体容易发生位置漂移、扩散现象，造成胚胎非正常二倍体率增加，影响胚胎发育与胚胎质量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供组蛋白去乙酰化酶抑制剂在培育克隆动物胚胎或转基因克隆动物胚胎中的应用。所述培育克隆动物胚胎或转基因克隆动物胚胎，包括如下步骤：1)将离体的供体细胞与离体的去核卵母细胞融合得到重构胚；2)将所述重构胚进行体外激活，其特征在于：所述方法还包括步骤1)和步骤2)之间的组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理包括以下步骤：将所述步骤1)的重构胚移入含组蛋白去乙酰化酶抑制剂的胚胎培养液中培养1-6小时。上述胚胎培养液是在CR1aa培养液中添加BSA和组蛋白去乙酰化酶抑制剂得到的培养液；所述胚胎培养液中BSA和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的终浓度为如下a)或b)：a)BSA为0.3-0.5g/100ml、组蛋白去乙酰化酶抑制剂为1.0-10.0ng/ml；b)BSA为0.4g/100ml、组蛋白去乙酰化酶抑制剂为10ng/ml；所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂是曲古抑菌素A(TSA)。上述培养的条件可以是38.5℃和5％CO2。其中CR1aa培养液的溶剂是水，溶质如表1所示。表1.CR1aa培养液的溶质 溶质 浓度(/L) NaCl 6.7g KCl 0.23g NaHCO3 2.2g 庆大霉素(Sigma，G1397) 50μL 乳酸半钙(hemicalcium lactate) 0.55g 丙酮酸钠(pyruvate) 0.04g L-谷氨酰胺(L-glutamine) 0.146g 非必需氨基酸(V/V)(Sigma，M7145) 1000μL 必需氨基酸(Sigma，B6766) 2000μL上述培养的时间可以为2-3小时。所述动物是猪、牛、羊或鼠实验证明：TSA处理激活前的重构胚可使染色体保持完整性，保证了移入核的遗传物质的完整性(图1)，并且TSA处理后，胚胎发育质量得到提高(7天囊胚细胞数从87.6提高到111.3)(表2)。附图说明图1为TSA处理对激活前重构胚染色质稳定性的影响。具体实施方式下列实施例中所用的原料若无特别说明均可从商业途径获得。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、体细胞克隆一、体细胞培养与处理1、牛成年成纤维细胞的分离、培养取离体的来自呼和浩特市一家饲养场的成年牛(中国赫斯坦牛)的耳尖组织。耳皮肤局部先用手术刀片刮毛，再用70％-75％的酒精消毒，用组织剪迅速剪取耳尖约1cm3大小的组织，立即在70％-75％的酒精中浸泡60s，在含250U/mL青霉素和250μg/mL链霉素的灭菌PBS中清洗2-3遍，放入相同溶液中，4℃带回实验室。在超净工作台内，耳组织于60mm培养皿中用PBS漂洗2遍后，放入青霉素瓶内，不加任何溶液，用眼科剪反复剪切组织块至约1mm3大小。用PBS和含20％FBS的DMEM(DMEM+20％FBS)各清洗3遍后，挑取组织块，接种于2-3个60mm培养皿中，每皿约接种20-30个组织块，放入CO2培养箱，在37℃，5％CO2饱和湿度条件下，进行干涸培养3h，然后加入5mL含DMEM+20％FBS进行原代培养。当细胞生长达到90％汇合时，吸出培养液，用灭菌PBS清洗3遍，加入1mL 0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液，37℃消化2-3min，立即加入2mL DMEM+10％FBS终止消化。然后按照1∶4传代。2、胎儿成纤维细胞的分离与培养采取活体手术法，自子宫中剥取妊娠40至60天的胎儿，在4℃带回实验室。将胎儿的头、蹄及内脏等器官去掉。把胎儿剪碎，按照步骤1的操作进行培养。3、细胞冻存、复苏及培养在步骤1、2中的细胞长至超过80％汇合时，用4-5mL PBS清洗3次，用0.25％胰蛋白酶，在37℃条件下，消化3min，吹打使之悬浮，然后收集细胞，1500rpm/min离心5min，弃去上清液，重悬细胞计数，在每个冷冻管中放入1×106个/mL细胞，并加入DMEM培养液、20％FBS、10％DMSO。先将冻存管放于4℃条件下平衡半小时，-20℃过夜，-80℃存放24hr后投入液氮冷冻。细胞的复苏：从液氮中取出冻存管，立即投入37℃水浴，待冰块刚刚融化，用酒精消毒冻存管外壁后，立即置于超净台中。将冻存管中细胞悬液移入10mL离心管内，用培养液清洗两次冻存管，清洗液移至离心管中，室温离心(1500rpm/min，5min)，弃上清。加入含10％FBS的DMEM培养液重悬细胞接种于60mm细胞培养皿中，37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养，待细胞生长至约70-80％汇合时，传代或用于核移植。核移植所用细胞为4-12代。二、卵母细胞的处理与核移植操作1、卵母细胞的处理按常规方法进行：卵母细胞的成熟培养：将离体的当地成年黄牛的卵巢(取自呼市屠宰场)用37℃的PBS液清洗三遍后，用直径为0.7mm的针头抽取直径为2-8mm的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体(COCs)，将其用成熟液(在M199培养液的基础上添加10％胎牛血清，丙酮酸钠0.38mM/L，0.01U/mL卵泡刺激素(bFSH)，0.01U/mL促黄体激素(bLH)和1μg/mL雌二醇，青霉素50μg/mL，链霉素100μg/mL得到的培养液，其中M199培养液购自Geibco或HyClone公司)洗涤两遍，然后将卵丘-卵母细胞-复合体按40-50枚/孔放入含成熟液的四孔板，置于38.5℃、5％CO2培养箱中成熟培养18-20h后，将成熟的卵母细胞放入含0.1％透明质酸酶的管内振荡2-3min，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离。然后，选择形态完整，细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞为胞质受体，也即获得了待去核的卵母细胞。2、核移植操作将步骤1获得的带有第一极体的卵母细胞移入操作液(在M199的基本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．组蛋白去乙酰化酶抑制剂在培育克隆动物胚胎或转基因克隆动物胚胎中的应用。
【技术特征摘要】
1.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在培育克隆动物胚胎或转基因克隆动物胚胎中的应
用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述培育克隆动物胚胎或转基因
克隆动物胚胎，包括如下步骤：1)将离体的供体细胞与离体的去核卵母细胞融合得
到重构胚；2)将所述重构胚进行体外激活，其特征在于：所述方法还包括步骤1)
和步骤2)之间的组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂处
理包括以下步骤：将所述步骤1)的重构胚移入含组蛋白去乙酰化酶抑制剂的胚胎
培养液中培养1-6小时。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述胚胎培养液是在CR1aa培养
液中添加BSA和组蛋白去乙酰化酶抑制剂得到的培养液；所述胚胎培养液中BSA和组
【专利技术属性】
技术研发人员：李光鹏，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：15
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