本发明专利技术提供一种TRAIL重组卡介苗的构建，涉及一种包含卡介苗主要分泌抗原Ag85B信号肽片段和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因片段的穿梭表达载体及其构建方法，得到的穿梭表达载体pMV261-Ag85B-TRAIL用于构建重组卡介苗rBCGTRAIL，可在制备治疗浅表性膀胱肿瘤和预防其术后复发以及预防结核病发生的TRAIL重组卡介苗中应用。本发明专利技术的重组卡介苗具有TRAIL和BCG的双重功能，可更好地发挥两者的协同增效作用；由于rBCGIL-TRAIL能够分泌TRAIL，在达到同样甚至增加免疫效果的条件下用量可低于BCG，从而降低了毒副作用；rBCGIL-TRAIL能够直接在局部高效分泌TRAIL，既可协同rBCGIL-TRAIL杀伤肿瘤细胞，又避免了使用外源细胞因子所带来的高额费用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，涉及一种分泌肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)的卡介苗穿梭表达载体 pMW61-Ag85B-TRAIL及其构建方法，即一种TRAIL重组卡介苗的构建及应用，具体涉及一种包含卡介苗主要分泌抗原Ag85B信号肽片段和TRAIL基因片段的穿梭表达载体及其构建方法，得到的穿梭表达载体pMW6l-Ag85B-TRAIL用于构建重组卡介苗rBCGTRAIL， rBCGTRAIL可应用于治疗浅表性膀胱肿瘤和预防其术后复发以及预防结核病发生。
技术介绍
卡介苗(Bacille Calmette-Guerin, BCG)膀胱灌注已被公认为是治疗浅表性膀胱肿瘤及预防术后复发最有效的治疗方法，其在减少肿瘤复发数目、降低复发频率以及预防低分化膀胱肿瘤进展三个方面，均优于传统的化疗药物。但随着BCG在临床的广泛应用，也出现了膀胱肿瘤患者对BCG灌注的免疫反应性差及BCG副作用大等问题。所以，改造BCG、 开发新疫苗成为膀胱肿瘤免疫治疗中的研究热点。近年来国内外日益重视BCG作为新型活疫苗载体的作用，并利用基因工程技术改造BCG，以加强其免疫原性。基因重组卡介苗(rBCG)是将BCG作为工程菌，利用DNA重组技术将外源基因导BCG中，依靠BCG在宿主的复制，分泌表达外源抗原，以诱导对疾病的特异性体液和细胞免疫，提高BCG激发的抗肿瘤免疫效应。用于治疗膀胱癌的rBCG可以分为两种，一种是表达结核杆菌的抗原Ag85B的 rBCG,可以降低活BCG剂量，提高其免疫效果，降低副作用；由于一些细胞因子(IFN- γ、 mIL-2、mIL-18等)可以提高机体的细胞免疫，对肿瘤细胞可以进行杀伤作用，但半衰期短、临床用量大，费用昂贵且副作用大，因此可利用BCG持久存在的特性，构建可分泌细胞因子的rBCG;构建rBCG除了选择有效的外源基因外，选择适当的穿梭载体也非常重要，构建rBCG除了选择有效的外源基因外，选择适当的穿梭载体也非常重要，如何将外源基因导入BCG并分泌表达是rBCG的关键所在，1987年Jacobs等首先构建穿梭载体(shuttle vector)并将外源基因成功导入BCG菌体内，方法是将分枝杆菌噬菌体DNA和大肠杆菌质粒 DNA连接获得重组质粒，将其转染到耻皮垢分枝杆菌(非致病性的快生长类分枝杆菌)中， 获得重组噬菌体。用重组噬菌体直接感染BCG从而将外源基因导入构建rBCG。这种穿梭载体既可作为质粒在大肠杆菌中复制，又可作为噬菌体在分枝杆菌中复制。但存在分子量大、 缺乏有用的单一酶切位点和抗性标志及在BCG中表达不稳定等缺点。1991年Mover构建大肠杆菌一分枝杆菌的穿梭质粒PMM61，添加了 aph基因(即karf抗性标记)、多克隆位点、分枝杆菌强启动子hsp60和转录终止子，pMV261在大肠杆菌和结核杆菌中均有正常表达，并且可随大肠杆菌的扩增而迅速扩增，所以很容易获得所需质粒。具有拷贝数高、高效表达重组蛋白以及对BCG基因组的非破坏性等优点。pMV261的构建成功为外源基因在BCG 中表达提供了理想的载体。细胞因子TRAIL可有效地抑制膀胱癌细胞的形成和生长，诱导肿瘤细胞的凋亡，可导致肿瘤缩小甚至消失，但对绝大多数正常细胞不产生杀伤作用，这是目前临床上使用大多数细胞因子“敌我不分”、具有强烈毒副作用所不能比拟的，因此TRAIL 是构建rBCG最有效的外源基因之一，rBCG-TRAIL有望成为治疗膀胱癌，降低临床BCG剂量和副作用的有效生物剂。目前，并没有有效的卡介苗穿梭表达载体pMM61-Ag85B-TRAIL的构建。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种TRAIL重组卡介苗的构建，其中的分泌型卡介苗穿梭表达载体 pMV261-Ag85B-TRAIL,具有 SEQ ID NO 1 所示序列，是在 pMV261 的 EcoR I 和 Hind III间插入TRAIL，然后在BamHI和EcoR I间插入Ag85B。所述的分泌型卡介苗穿梭表达载体pMM61-Ag85B-TRAIL通过以下构建方法实现(1) PCR扩增Ag85B信号肽片段和RT-PCR获取目的基因TRAIL，并对其筛选、鉴定；(2)利用DNA重组技术，将以上两个片段插入质粒PMM61的HSP60启动子下游， TRAILDNA与pMW61分别用EcoRI和Hind III进行酶切连接，得重组质粒pMW61_TRAIL， BCG基因组DNA的抽提，并且PCR扩增信号肽基因BCG-85B-SS，将pMV261_TRAIL和 BCG-85B-SS分别用EcoRI和BamHI进行酶切连接，得重组质粒pMV261_Ag85B_TRAIL ；(3)分泌型BCG穿梭表达载体pMM61-Ag85B-TRAIL转化大肠杆菌、抽提和纯化；(4)对pMV261-Ag85B-TRAIL进行酶切、PCR扩增及DNA测序鉴定。TRAIL PCR 扩增上游引物序列 5，-GACGAATTCTACATGTACTTCACCAACG-3，，F 5'端引入 EcoRI 识别序列 G' AATTC，下游引物序列 5，-CGCAAGCTTCTAGTTAATTAAAAAGGCTCC-3，， R 5'端引入Hind III识别序列A' AGCTT0本专利技术的另一个目的是提供所述的TRAIL重组卡介苗在制备预防和治疗浅表性膀胱肿瘤和预防其术后复发的重组卡介苗rBCGTRAIL中的应用，以及在制备预防和治疗结核病的重组卡介苗rBCGTRAIL中的应用，通过以下步骤实现(1)将经过pMM61-Ag85B_TRAIL转化感受态细菌E. coli DH5 α或X_blue的克隆菌落进行PCR、酶切、和测序鉴定；(2)将冻干BCG制剂用生理盐水融化，加入2ml细菌溶液，纱布封口后轻轻摇勻，倒入三角烧瓶置于37°C，转速为150rpm的恒温摇床中培养；BCG培养两周左右，OD600值约为 0. 6时，进行接种，分别移种于新培养基中大量培养或者冻存；(3)制备感受态BCG =BCG在Middlebrook 7H9培养基37 °C摇床培养，待培养液 OD600值约0. 6时将BCG菌液加入离心管中，冰浴2hr将BCG菌液加入离心管中，在冰盒中预冷air，4°C离心8000rpmX15min，丢弃上清；用原始体积的1/10、预冷的浓度为10%甘油重悬菌体；重复上述操作共五次，弃上清，加入原始体积1/50的10%甘油重悬菌体即得到感受态细菌，放置室温下备用；(4)构建重组卡介苗rBCGTRAIL:在一微量离心管中温和混勻200 μ L感受态 BCG (约 lX109cfu/ml)和 10 μ L 穿梭表达质粒 pMV261_Ag85B_TRAIL (约 2 μ g)；冰浴 IOmin 后，转入预冷的0. 2CM的电击转化杯中，置于基因脉冲仪中进行电转，电转参数Voltage: 1250V, Capacitance :25 μ F，Resistance :600 Ω ；质粒 pMV261-Ag85B_TRAIL，pMV261 及单纯BCG的作用时间分别为11. 6，13，12毫秒；电转完成后，迅速加Mi本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种ＴＲＡＩＬ重组卡介苗的构建方法，其特征在于，其中的分泌型卡介苗穿梭表达载体ｐＭＶ２６１－Ａｇ８５Ｂ－ＴＲＡＩＬ具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的序列，所述载体是在ｐＭＶ２６１的ＥｃｏＲ Ｉ和Ｈｉｎｄ ＩＩＩ间插入ＴＲＡＩＬ，然后在ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲ Ｉ间插入Ａｇ８５Ｂ，分泌型卡介苗穿梭表达载体ｐＭＶ２６１－Ａｇ８５Ｂ－ＴＲＡＩＬ的构建方法通过以下步骤实现：（１）ＰＣＲ扩增Ａｇ８５Ｂ信号肽片段和ＲＴ－ＰＣＲ获取目的基因ＴＲＡＩＬ，并对其筛选、鉴定；（２）利用ＤＮＡ重组技术，将以上两个片段插入质粒ｐＭＶ２６１的ＨＳＰ６０启动子下游，ＴＲＡＩＬＤＮＡ与ｐＭＶ２６１分别用ＥｃｏＲＩ和Ｈｉｎｄ ＩＩＩ进行酶切连接，得重组质粒ｐＭＶ２６１－ＴＲＡＩＬ，ＢＣＧ基因组ＤＮＡ的抽提，并且ＰＣＲ扩增信号肽基因ＢＣＧ－８５Ｂ－ＳＳ，将ｐＭＶ２６１－ＴＲＡＩＬ和ＢＣＧ－８５Ｂ－ＳＳ分别用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ进行酶切连接，得重组质粒ｐＭＶ２６１－Ａｇ８５Ｂ－ＴＲＡＩＬ；（３）分泌型ＢＣＧ穿梭表达载体ｐＭＶ２６１－Ａｇ８５Ｂ－ＴＲＡＩＬ转化大肠杆菌、抽提和纯化；（４）对ｐＭＶ２６１－Ａｇ８５Ｂ－ＴＲＡＩＬ进行酶切、ＰＣＲ扩增及ＤＮＡ测序鉴定；其中ＴＲＡＩＬ ＰＣＲ扩增上游引物序列为５’－ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧ－３’，Ｆ ５′端引入ＥｃｏＲ Ｉ识别序列Ｇ′ＡＡＴＴＣ，下游引物序列为５’－ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＧＧＣＴＣＣ－３’，Ｒ ５′端引入Ｈｉｎｄ ＩＩＩ识别序列Ａ′ＡＧＣＴＴ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈周俊，陈善闻，周卸来，章国卫，金晓东，
申请(专利权)人：沈周俊，
类型：发明
国别省市：31
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