用于检测柠檬黄的方法及酶联免疫试剂盒技术

本发明专利技术公开了用于检测柠檬黄的方法及酶联免疫试剂盒。本发明专利技术所提供的检测柠檬黄的酶联免疫试剂盒，包括柠檬黄半抗原和柠檬黄的特异性抗体；所述特异性抗体为所述柠檬黄的多克隆抗体或单克隆抗体。本试剂盒中采用高特异性的柠檬黄单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性，实验结果表明，本试剂盒具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点；本试剂盒的主要试剂都采用工作液形式，使用方便，成本低廉。用本发明专利技术试剂盒检测柠檬黄的方法，操作简便，对样品的前处理要求低，能同时快速检测大批量样品。因此，利用本发明专利技术酶联免疫试剂盒进行检测的方法，能够进行现场监控且适合大量样品的定性和定量筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测柠檬黄的方法及酶联免疫试剂盒。
技术介绍
柠檬黄色素是目前我国批准使用的六种食用合成色素之一，被广泛应用于食品、 药品、化妆品、医疗器具、烟草、饲料、食用包装、日化品、玩具等领域。其分子结构为偶氮化合物，在体内代谢的产物为对人体具有潜在危害的芳香类化合物。因此，我国对在食品中的柠檬黄色素有严格限制。如果人们长期或一次性大量食用柠檬黄含量超标的食品，可能会引起过敏、腹泻等症状，当摄入量过大，超过肝脏负荷时，会在体内蓄积，对肾脏、肝脏产生一定伤害。目前，柠檬黄国家标准所采取的检测方法是薄层分析及分光光度计法，近年来， 我国科研工作者在柠檬黄检测方面做了大量的工作，但都主要集中在理化检测方面，文献检索尚未发现关于柠檬黄的ELISA检测方法的报道，鉴于此，本专利技术研究和建立了柠檬黄的直接竞争ELISA检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有柠檬黄检测产品中存在的不足，提供一种高特异性、高灵敏度、价格低廉、操作简单，能大批量快速检测柠檬黄的酶联免疫试剂盒。本专利技术的另一目的是提供利用上述酶联免疫试剂盒检测柠檬黄残留的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下测定原理首先将柠檬黄抗原包被于固相载体，例如酶标板上，然后加入标准品或待测样品，再加入酶标记柠檬黄抗体，包被抗原与标准品/待测样品中的柠檬黄竞争酶标抗体，待测样品柠檬黄含量高时，则与固相抗原结合的酶标抗体就少，反之结合在固相抗原上的酶标抗体就多，与固相抗原结合酶标抗体就越少，发色反应减弱，百分吸光度值低，反之，则发色反应增强，百分吸光度增高，以百分吸光度值为纵坐标，柠檬黄标准品浓度的半对数为横坐标作图即得标准曲线，再根据柠檬黄的标准曲线和待检样品的百分吸光度值，即可推算出待测样品中柠檬黄的浓度。本专利技术的具体技术方案为提供一种检测柠檬黄的酶联免疫试剂盒，包括柠檬黄抗原和柠檬黄的特异性抗体；所述特异性抗体为柠檬黄的多克隆抗体或单克隆抗体。提供一种柠檬黄残留的酶联免疫检测试剂盒，包含下列成分(1)包被了柠檬黄抗原的酶标板(2)酶标记柠檬黄抗体工作液(3)柠檬黄标准溶液(4)底物显色液(5)反应终止液(6)浓缩洗涤液(7)样品稀释浓缩液所述酶标板采是96或40孔酶标板，酶标板孔内包被有能与抗柠檬黄抗体特异结合的柠檬黄抗原，所用的包被液为PH9. 6、0. 05mol/L的碳酸盐缓冲溶液，碳酸盐缓冲溶液含1 2g碳酸钠、2 4g碳酸氢钠和双蒸水1L，封闭液为pH7. 4，含有5%山羊血清、10g/L 酪蛋白的0. 02mol/L磷酸盐缓冲液。所述酶标记柠檬黄抗体工作液为采用过碘酸盐法将酶与柠檬黄抗体进行偶联得到的。所用标记酶可为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，本专利技术优选为辣根过氧化物酶，且采用改良后的过碘酸盐氧化法进行标记，提高了标记效率，节省了酶与抗体的用量，保证标记后酶与抗体具有良好的活性。所述柠檬黄标准溶液的浓度为0μ g/mL、l μ g/mL、3 μ g/mL、9 μ g/mL、27 μ g/mL、 81 μ g/ml0当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液为过氧化氢或过氧化脲、四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液，所述终止液为1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氢氧化钠溶液。当标记酶为细菌提取的碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液由底物液和底物缓冲液组成，底物液为对硝基磷酸盐缓冲液，底物缓冲液为含有过氧化氢或氧化脲的pH = 5. 0磷酸-柠檬酸缓冲溶液，所述终止液为1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氢氧化钠溶液。 所述浓缩洗涤液为含5 %吐温-20的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液pH = 7. 4，浓度为0. lmol/L,为正常使用浓度的10倍。所述样品稀释液为0. 01mol/L磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液pH = 7. 4。其中，酶标记柠檬黄抗体是如下制备的将柠檬黄抗体与辣根过氧化物(HRP)采用过碘酸钠法进行偶联。具体方法为a)溶解5mg HRP于Iml超纯水中，加入新配制的0. lmol/L多碘酸钠75 μ L，置室温或4°C冰箱反应20分钟或30分钟。b)反应完后装入透析袋，O.OOlmol/L pH = 4. 0醋酸缓冲液4°C透析过夜，期间按需更换透析液。c)将抗体用0. Olmol/L碳酸缓冲液稀释至10mg/L，另外用0. Olmol/L碳酸缓冲液将活化好的HRP的溶液pH调至9. 5。将0. 5ml抗体加入HRP溶液中，置室温或4°C冰箱反应2小时。d)加入100 μ L 4mg/mL硼氢化钠，4°C冰箱反应2小时。e)对0. Olmol/LPBS透析过夜，加入保存液_20°C保藏备用。其中，酶标板的制备方法为用包被缓冲液将柠檬黄抗原按需要稀释，向酶联板微孔中加入抗原稀释液，放入 37°C环境进行孵育，再放入4°C环境中过夜孵育，得到的酶联板的稳定性好，倾去包被液，用洗涤液洗涤，然后在每孔中加入封闭液，37°C孵育，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。本专利技术同时提供了利用上述酶联免疫试剂盒进行食品中柠檬黄检测的使用方法(1)样品前处理；(2)使用试剂盒进行检测；(3)结果处理与分析。本专利技术提供待测样品前处理方法为当所述样品为液体食品时，所述样品前处理方法为将液体食品除去气体，与样本稀释液以体积比1 5-10混合，取混合后样品用于分析；当所述样品为面糊、调味果酱类食品时，所述样品前处理方法为将待检物与样本稀释液以质量体积比为1 10-15混勻，离心，取上清与样本稀释以一定比例稀释后检测。当所述样品为果酱、半固体复合调味料时，样品置于水浴溶解/均质，加一定量的正己烷脱脂，与样本稀释液以质量体积比为1 10-15混勻，离心，取下层检测。使用试剂盒检测的方法为(1)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温平衡；(2)将标准品或待测样品加入已经包被有柠檬黄抗原的酶标板孔内，然后每孔加入酶标记物，轻拍混勻，孵育；(3)洗涤；(4)每孔加入底物显色液，轻拍混勻，避光孵育；(5)每孔加入反应终止液，混合均勻，在波长450nm下，以空气为空白，酶标仪测定各孔吸光值；本专利技术提供的检测结果处理与分析方法为以所获标准样品吸光值的平均值计算百分吸光度值，以百分吸光度值为纵坐标， 柠檬黄标准溶液浓度的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。用同样的方法计算样品溶液的百分吸光度值，根据方程式求出对应对应样品的柠檬黄浓度。所述百分吸光度值的计算式为百分吸光度值(％) = (B/B0) X 100其中，B为标准溶液或样品的平均吸光值，Btl为0 μ g/mL标准溶液的平均吸光度值。柠檬黄线性检测范围为0-135 μ g/ml，检测限为1 μ g/ml，整个检测过程只需30分钟就可以完成。本专利技术提供了一种检测样品中的柠檬黄含量的方法，包括以下步骤1)用柠檬黄抗原包被酶标板；2)加入柠檬黄标准品或待测样品；3)加入酶标记的柠檬黄特异性抗体，孵育，洗涤；4)加入底物显色液显色；5)加入反应终止液终止反应；6)通过比较柠檬黄标准品与待测样品的颜色，推测出待测样品中的柠檬黄含量； 或者，测定各孔的吸光度，建立柠檬黄浓度相对于吸光度的标准曲线，并根据该标准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的柠檬黄含量。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种检测柠檬黄的酶联免疫试剂盒，包括柠檬黄抗原和柠檬黄的特异性抗体；所述特异性抗体为柠檬黄的多克隆抗体或单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张波，王飞，郗日沫，王鹏，易建，张霞，薛秋艳，徐德顺，
申请(专利权)人：天津百鸥瑞达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：12