用于检测日落黄的方法及酶联免疫试剂盒技术

本发明专利技术公开了用于检测日落黄的方法及酶联免疫试剂盒。本发明专利技术所提供的检测日落黄的酶联免疫试剂盒，包括日落黄半抗原和日落黄的特异性抗体；所述特异性抗体为所述日落黄的多克隆抗体或单克隆抗体。本试剂盒中采用高特异性的日落黄单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性，实验结果表明，本试剂盒具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点；本试剂盒的主要试剂都采用工作液形式，使用方便，成本低廉。用本发明专利技术试剂盒检测日落黄的方法，操作简便，对样品的前处理要求低，能同时快速检测大批量样品。因此，利用本发明专利技术酶联免疫试剂盒进行检测的方法，能够进行现场监控且适合大量样品的定性和定量筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测日落黄的方法及酶联免疫试剂盒。
技术介绍
日落黄色素是目前我国批准使用的六种食用合成色素之一，主要用于食品和药物的着色，也可用于制造铝盐色淀颜料。中国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-2007)规定日落黄可用于果汁饮料、碳酸饮料、浓缩果汁、糖果、糕点、西瓜酱罐头、虾片类膨化制品、植物蛋白饮料及乳酸菌饮料中，最大使用量为0. 10g/kg ；用于冷冻饮品最大使用量为 0. 09g/kg ；用于糖果包衣及红绿丝，最大使用量为0. 20g/kg。其分子结构为偶氮化合物，在体内代谢的产物为对人体具有潜在危害的芳香类化合物。因此，我国对食品中的日落黄色素有严格限制。如果人们长期或一次性大量食用日落黄含量超标的食品，可能会引起过敏、 腹泻等症状，当摄入量过大，超过肝脏负荷时，会在体内蓄积，对肾脏、肝脏产生一定伤害。目前，日落黄国家标准所采取的检测方法是薄层层析法、分光光度计法、荧光光谱法及高效液相色谱法。近年来，我国科研工作者在日落黄检测方面做了大量的工作，但都主要集中在理化检测方面，文献检索尚未发现关于日落黄的EL ISA检测方法的报道，鉴于此， 本专利技术研究和建立了日落黄的竞争EL ISA检测方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测日落黄的酶联免疫试剂盒。本专利技术所提供的检测日落黄的酶联免疫试剂盒，包括日落黄半抗原和日落黄的特异性抗体；所述特异性抗体为日落黄的多克隆抗体或单克隆抗体；其中，所述半抗原和日落黄的特异性抗体可以以下述任一种形式存在1)将日落黄半抗原与载体蛋白进行偶联，得到日落黄半抗原与载体蛋白的偶联物 (以下称为半抗原-载体蛋白偶联物)，将其作为包被原，所述特异性抗体进行酶标记后作为酶标记物；2)所述特异性抗体为包被原，所述半抗原进行酶标记后作为酶标记物。所述试剂盒还可以既包括半抗原和日落黄的特异性抗体，又包括抗抗体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体；其中，所述半抗原和抗抗体以下述任一形式存在1)将所述半抗原与载体蛋白进行偶联，得到半抗原-载体蛋白偶联物，将其作为包被原，所述抗抗体进行酶标记后作为酶标记物；2)所述抗抗体为包被原，所述半抗原进行酶标记后作为酶标记物。所述日落黄多克隆抗体或日落黄单克隆抗体，均是用所述日落黄半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原得到的；所述载体蛋白可为甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、血蓝蛋白或卵清蛋白等。所述单克隆抗体是通过杂交瘤细胞技术得到的。所述日落黄多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体。为了方便检测，所述试剂盒还包括酶标板，当所述日落黄特异性抗体或抗抗体用酶进行标记时，所述酶标板上包被有所述日落黄半抗原或日落黄半抗原-载体蛋白偶联物；当所述半抗原用酶进行标记时，所述酶标板上包被有所述日落黄特异性抗体或所述抗抗体。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还可包括日落黄标准品溶液、 显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液中的至少一种；其中，所述浓缩洗涤液为pH值为6-9、含有在所述浓缩洗涤液中的终浓度为 0. 02-0. 05% (质量百分含量)防腐剂、在所述浓缩洗涤液中的终浓度为1.0-2.0% (质量百分含量)吐温-20、0. 1-0. 2mol/L的磷酸盐缓冲液；所述浓缩复溶液为含有在所述浓缩复溶液中的终浓度为5-10% (质量百分含量)的DMS0、PH为6-8、0. 1-0. 2mol/L的磷酸盐缓冲液。所述酶标记中所用的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液为过氧化氢或过氧化脲、四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液，所述终止液为l_2mol/L硫酸溶液或盐酸溶液。当标记为碱性磷酸酶时，显色剂为硝基磷酸盐缓冲液，终止液为l_2mol/L氢氧化钠溶液。所述浓缩洗涤液具体可以为pH值为7. 4、含有在所述浓缩洗涤液中的终浓度 0. 03%防腐剂、在所述浓缩洗涤液中的终浓度为1.50%的吐温-20、0. 2mol/L磷酸盐缓冲液；所述浓缩复溶液具体可以为含有在所述浓缩复溶液中的终浓度为8%的DMSO、pH为 7. 4,0. 2mol/L磷酸盐缓冲液；所述底物显色液为过氧化氢或过氧化脲，四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液，所述终止液为2mol/L硫酸溶液或盐酸溶液。日落黄是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。将日落黄半抗原与牛血清蛋白采用碳化二亚胺法进行偶联得到免疫原，日落黄半抗原与载体蛋白的比例过低或过高都对免疫不利，半抗原与牛血清蛋白的结合摩尔比为23-28 1较合适。在制备包被原时，日落黄半抗原与所述载体蛋白的摩尔配比为26 1比较合适。日落黄半抗原是通过将日落黄与二乙酸叔丁酯通过化学反应得到的。制作包被有包被原的酶标板时，所述包被缓冲液可以为PH值为9.0-9.6、 0. 05mol/L碳酸盐缓冲液，封闭液为pH6-8，含有5% -8%山羊血清、10g/L酪蛋白的 0. 02mol/L磷酸盐缓冲液。本专利技术的另一个目的是提供一种检测日落黄的方法。本专利技术所提供的一种检测样品中的日落黄含量的方法，包括以下步骤1)用日落黄半抗原或日落黄半抗原-载体蛋白偶联物包被酶标板；2)将日落黄标准品或待测样品加入所述包被的酶标板孔内，然后每孔加入酶标记的日落黄特异性抗体，孵育，洗涤；3)加入底物显色液显色；4)加入反应终止液终止反应；5)通过比较日落黄标准品与待测样品的颜色，推测出待测样品中的日落黄含量； 或者，测定各孔的吸光度，建立日落黄浓度相对于吸光度的标准曲线，并根据该标准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的日落黄含量。本专利技术所提供的另一种检测样品中的日落黄含量的方法，包括以下步骤1)用日落黄半抗原或日落黄半抗原_载体蛋白偶联物包被酶标板；2)加入日落黄标准品或待测样品；3)加入日落黄特异性抗体，孵育，洗涤；4)加入酶标记的抗抗体，孵育，洗涤；5)加入底物显色液显色；6)加入反应终止液终止反应；7)通过比较日落黄标准品与待测样品的颜色，推测出待测样品中的日落黄含量； 或者，测定各孔的吸光度，建立日落黄浓度相对于吸光度的标准曲线，并根据该标准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的日落黄含量。在本专利技术所提供的检测样品中的日落黄含量的方法，还可以包括样品前处理步骤当所述样品为液体食品时，所述样品前处理方法为将液体食品除去气体，与样本稀释液以体积比1 10-15混合，取混合后样品用于分析；当所述样品为糖果、话梅类食品时，所述样品前处理方法为将待检物粉碎，与样本稀释液以质量体积比为1 5-10混勻，再加入一定体积的正己烷脱脂，离心，取上清与样本稀释以一定比例稀释后检测。当所述样品为冰激凌时，样品置于水浴溶解，加一定量的正己烷脱脂，与样本稀释液以质量体积比为1 10-15混勻，离心，取下层检测。当所述样品为糕点时，均质化，加入一定体积的正己烷，混勻，与样本稀释液以质量体积比1 10-15混勻，离心，取下层检测。本专利技术的检测日落黄的酶联免疫试剂盒采用直接竞争及间接竞争ELISA方法定性或定量检测样品中日落黄的含量。本试剂盒中采用高特异性的日落黄单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性。实验本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种检测日落黄的酶联免疫试剂盒，包括日落黄半抗原和日落黄的特异性抗体；所述特异性抗体为日落黄的多克隆抗体或单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张波，王飞，郗日沫，王鹏，易建，张霞，薛秋艳，徐德顺，
申请(专利权)人：天津百鸥瑞达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：12