用于检测诱惑红的方法及酶联免疫试剂盒技术

本发明专利技术公开了用于检测诱惑红的方法及酶联免疫试剂盒。本发明专利技术所提供的检测诱惑红的酶联免疫试剂盒，包括诱惑红半抗原和诱惑红的特异性抗体；所述特异性抗体为所述诱惑红的多克隆抗体或单克隆抗体。本试剂盒中采用高特异性的诱惑红单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性，实验结果表明，本试剂盒具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点；本试剂盒的主要试剂都采用工作液形式，使用方便，成本低廉。用本发明专利技术试剂盒检测诱惑红的方法，操作简便，对样品的前处理要求低，能同时快速检测大批量样品。因此，利用本发明专利技术酶联免疫试剂盒进行检测的方法，能够进行现场监控且适合大量样品的定性和定量筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测诱惑红的方法及酶联免疫试剂盒。
技术介绍
诱惑红是食用色素的一种，呈鲜艳的深红色，单色品种。该色素稳定性优良，被广泛用于食品、饮料、药品、化妆品、饲料、烟草、玩具、食品包装材料等的着色。水溶性合成色素，鲜艳的深红色，应用于糖果包衣、冰淇淋、雪糕、糖果、糕点、饮料等的着色。但是长期食用诱惑红对身体会产生危害，为一般毒性、致泻性甚至致癌性，尤其是偶氮化合物类合成色素的致癌作用明显。偶氮化合物在体内分解，可形成丙种芳香胺化合物，芳香胺在体内经过代谢活动后与靶细胞作用可能引起癌变。此外，食用合成色素在生产过程中还可能混入砷和铅，能导致皮下肉瘤、肝癌、肠癌及恶性淋巴癌等。诱惑红属于食用红色色素。中国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760 ？ D1996)中规定诱惑红可用于糖果包衣，最大使用量0. 085g/kg;用于冰淇淋、雪糕、苹果干、燕麦片 (调香、调色载体)、可可玉米片(即食早餐谷类食品)为0. 07g/kg ；用于炸鸡调料为0. 04g/ kg ；用于冰棍、糖果、糕点彩装、红绿丝、染色樱桃罐头、红肠肠衣、果汁饮料、果汁酒(色淀除外)，最大用量0. 05g/kg ；用于果汁(味)型饮料，0. 025g/kg(按稀释6倍计)。通常，检测诱惑红的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、纸上层析法、分光光度法等等。HPLC法与分光光度法是诱惑红残留检测的确证方法，其优点是检测精确度高，但因其仪器化程度高、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等而阻碍其推广应用。理化检测法多以有机溶剂萃取后过层析柱，然后观察颜色进行诱惑红残留的判断，此方法主观性强，对微量残留很难进行测定，而且无法定量，因此很难符合检测单位实际使用的要求。而酶联免疫分析(ELISA)快速检测技术因灵敏度高、特异性好、既可定性又可定量，且成本低、操作简单快速、一次检测样本量大、仪器化程度低，现已成为常用的筛选方法。并且经过检索相关的文献与专利并未发现国内外有关于诱惑红免疫检测的方法与试剂盒。总之，现有酶联免疫试剂盒采用的检测方法复杂、繁琐，很难应用于实践，且现有技术由于普遍存在稳定性差、样品前处理及检测步骤复杂、设备条件要求较高、价格昂贵等不足，严重影响了诱惑红残留检测与监控，因此研制稳定性高、操作简单、设备要求低、廉价的诱惑红ELISA检测试剂盒具有非常重要的经济和社会意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测诱惑红的酶联免疫试剂盒。本专利技术所提供的检测诱惑红的酶联免疫试剂盒，包括诱惑红半抗原和诱惑红的特异性抗体；所述特异性抗体为诱惑红的多克隆抗体或单克隆抗体；其中，所述半抗原和诱惑红的特异性抗体可以以下述任一种形式存在1)将诱惑红半抗原与载体蛋白进行偶联，得到诱惑红半抗原与载体蛋白的偶联物 (以下称为半抗原_载体蛋白偶联物)，将其作为包被原，所述特异性抗体进行酶标记后作为酶标记物；2)所述特异性抗体为包被原，所述半抗原进行酶标记后作为酶标记物。所述试剂盒还可以既包括半抗原和诱惑红的特异性抗体，又包括抗抗体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体；其中，所述半抗原和抗抗体以下述任一形式存在1)将所述半抗原与载体蛋白进行偶联，得到半抗原-载体蛋白偶联物，将其作为包被原，所述抗抗体进行酶标记后作为酶标记物；2)所述抗抗体为包被原，所述半抗原进行酶标记后作为酶标记物。所述诱惑红多克隆抗体或诱惑红单克隆抗体，均是用所述诱惑红半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原得到的；所述载体蛋白可为甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、血蓝蛋白或卵清蛋白等。所述单克隆抗体是通过杂交瘤细胞技术得到的。所述诱惑红多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体。为了方便检测，所述试剂盒还可包括酶标板，当所述诱惑红特异性抗体或抗抗体用酶进行标记时，所述酶标板上包被有所述诱惑红半抗原或诱惑红半抗原_载体蛋白偶联物；当所述半抗原用酶进行标记时，所述酶标板上包被有所述诱惑红特异性抗体或所述抗抗体。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还可包括诱惑红标准品溶液、 显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液中的至少一种；其中，所述浓缩洗涤液为pH值为6-9、含有在所述浓缩洗涤液中的终浓度为 0. 02-0. 05% (质量百分含量)防腐剂、在所述浓缩洗涤液中的终浓度为1.0-2.0% (质量百分含量)吐温-20、0. 1-0. 2mol/L的磷酸盐缓冲液；所述浓缩复溶液为含有在所述浓缩复溶液中的终浓度为5-10% (质量百分含量)的DMS0、pH为6-8、0. 1-0. 2mol/L的磷酸盐缓冲液。所述酶标记中所用的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液为过氧化氢或过氧化脲、四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液，所述终止液为l-2mol/L硫酸溶液或盐酸溶液。当标记为碱性磷酸酶时，所述显色液为硝基磷酸盐缓冲液，终止液为l-2mol/L氢氧化钠溶液。所述浓缩洗涤液具体可以为pH值为7. 4、含有在所述浓缩洗涤液中的终浓度 0. 03%的防腐剂、在所述浓缩洗涤液中的终浓度为1.50%的吐温-20、0. 2mol/L磷酸盐缓冲液；所述浓缩复溶液具体可以为含有在所述浓缩复溶液中的终浓度为8%的DMSO、pH为 7. 4,0. 2mol/L磷酸盐缓冲液；所述底物显色液为过氧化氢或过氧化脲、四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液，所述终止液为2mol/L硫酸溶液或盐酸溶液。诱惑红是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。将诱惑红半抗原与牛血清蛋白采用碳化二亚胺法进行偶联得到免疫原，诱惑红半抗原与载体蛋白的比例过低或过高都对免疫不利，半抗原与牛血清蛋白的结合摩尔比为23-28 1较合适。在制备包被原时，诱惑红半抗原与所述载体蛋白的摩尔配比为26 1比较合适。诱惑红半抗原是通过将诱惑红与二乙酸叔丁酯通过化学反应得到的。制作包被有包被原的酶标板时，所述包被缓冲液可以为PH值为9.0-9.6、0. 05mol/L碳酸盐缓冲液，封闭液为pH6-8，含有5% -8%山羊血清、10g/L酪蛋白的 0. 02mol/L磷酸盐缓冲液。本专利技术的另一个目的是提供一种检测诱惑红的方法。本专利技术所提供的一种检测样品中的诱惑红含量的方法，包括以下步骤1)用诱惑红半抗原或诱惑红半抗原-载体蛋白偶联物包被酶标板；2)将诱惑红标准品或待测样品加入所述包被的酶标板孔内，然后每孔加入酶标记的诱惑红特异性抗体，孵育，洗涤；3)加入底物显色液显色；4)加入反应终止液终止反应；5)通过比较诱惑红标准品与待测样品的颜色，推测出待测样品中的诱惑红含量； 或者，测定各孔的吸光度，建立诱惑红浓度相对于吸光度的标准曲线，并根据该标准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的诱惑红含量。本专利技术所提供的另一种检测样品中的诱惑红含量的方法，包括以下步骤1)用诱惑红半抗原或诱惑红半抗原-载体蛋白偶联物包被酶标板；2)加入诱惑红标准品或待测样品；3)加入诱惑红特异性抗体，孵育，洗涤；4)加入酶标记的抗抗体，孵育，洗涤；5)加入底物显色液显色；6)加入反应终止液终止反应；7)通过比较诱惑红标准品与待测样品的颜色，推测出待本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种检测诱惑红的酶联免疫试剂盒，包括诱惑红半抗原和诱惑红的特异性抗体；所述特异性抗体为诱惑红的多克隆抗体或单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张波，王飞，郗日沫，王鹏，易建，张霞，薛秋艳，徐德顺，
申请(专利权)人：天津百鸥瑞达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：12