本发明专利技术的目的是提供一种简便、快速、灵敏度高和全自动化的苯巴比妥药物浓度检测设备及其制备方法，为了解决上述技术问题，本发明专利技术提供一种苯巴比妥均相酶免疫检测试剂盒及其制备方法，包括苯巴比妥免疫原的合成，抗苯巴比妥特异性抗体的制备，酶标偶联物的制备以及样本的测定。本发明专利技术的苯巴比妥药物浓度均相酶免疫检测试剂盒准确度和精确度高，血清标本的平均回收率大于95％，相关系数偏差小于2.5％。该试剂盒中提供的苯巴比妥抗体的特异性强，药物交叉反应试验中，对测试的30种常见药物和化合物几乎无任何交叉反应，适合临床检测苯巴比妥的血药浓度。本发明专利技术的试剂盒简便、快速、成本低、灵敏度高、可全自动化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学检验领域，具体涉及。
技术介绍
苯巴比妥(1-(4-carboxybutyle) _5_ethyl_5_phenylbarbituricacid, 1_ (4_ 幾丁基)-5_乙基-5-苯基-巴比妥酸)是临床上常用的抗癫痫、抗惊厥、稳定情绪类的药物， 由于治疗的有效血药浓度范围狭窄，药物的药动学个体间差异显著，血药浓度与治疗效果密切相关，血药浓度过高时可产生严重的毒副作用，可导致呼吸中枢衰竭，甚至危及生命， 血药浓度过低则无治疗效果，因此在治疗期间对病人的血药浓度进行监测，对开展个性化治疗具有重要的临床指导意义。目前，国内外测定苯巴比妥血药浓度的方法主要是高效液相色谱(HPLC)、微粒酶免法、免疫比浊法、发光免疫、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)等免疫法。采用HPLC法，需要样本前处理，操作较复杂、周期较长、且成本昂贵；ELISA检测法灵敏度高，但只能半定量; 发光免疫检测法虽然具有操作简单、灵敏度高等优点，但试剂成本昂贵，不适合常规治疗药物的检测，不利于个性化治疗的推广。因此开发一种操作简便、周期短、成本低、灵敏度高的检测方法成为急待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简便、快速、灵敏度高和全自动化的苯巴比妥药物浓度检测试剂盒和制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是提供一种苯巴比妥均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于，包括以下几种组分试剂Rl 苯巴比妥衍生物特异的多克隆抗体；试剂R2 葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯巴比妥衍生物；试剂R3:定标液；所述定标液为苯巴比妥校准品溶于空白血清中制得； 所述葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯巴比妥衍生物为苯巴比妥衍生物与葡萄糖六磷酸脱氢酶偶联产物，所述葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯巴比妥衍生物能与苯巴比妥衍生物特异抗体特异性结合；所述苯巴比妥衍生物特异的多克隆抗体是以苯巴比妥衍生物与牛血清白蛋白偶联的产物为免疫抗原制得。优选的，所述定标液为6种不同苯巴比妥质量浓度的溶液，所述定标液苯巴比妥质量浓度分别为 0 μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL、20 μ g/mL、40 μ g/mL、80 μ g/mL。优选的，所述葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯巴比妥衍生物稀释度为1 1000-1 3000，苯巴比妥衍生物特异的多克隆抗体稀释度为1 500-1 4000。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的另一个技术方案是提供一种苯巴比妥均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤苯巴比妥衍生物特异的单克隆或多克隆抗体的制备；葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的特异抗原的制备；定标液的制备。优选的，所述苯巴比妥衍生物特异的多克隆抗体的制备包括以下步骤步骤a:将牛血清白蛋白溶解于0. 2mol/L的pH8. 5的磷酸缓冲液中；苯巴比妥衍生物的活化将特异的苯巴比妥衍生物IOmg置于容器中，并依次加入 350 μ L 二甲基酰胺、350 μ L乙醇、700 μ L磷酸钾缓冲液、40mgl-乙基-3- (-3- 二甲氨丙基) 碳二亚胺和5mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺；所述磷酸钾缓冲液浓度为10mmol/L，pH值为5. 0 ；步骤b 苯巴比妥衍生物免疫抗原的偶联和纯化将步骤a活化的苯巴比妥衍生物滴加到步骤a所得的牛血清白蛋白溶液中，在2 8°C条件下搅拌12-16小时，将偶联的抗原进行孔径为8KD的透析袋透析纯化；步骤c 采用步骤b得到的苯巴比妥衍免疫抗原制备苯巴比妥衍生物抗体。优选的，所述步骤c为将步骤b合成的苯巴比妥免疫抗原用lOmmol/L，pH7. 4的磷酸缓冲液稀释至 1.0mg/mL，然后用苯巴比妥免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对兔子进行注射，14-21天后，再用相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对家兔注射一次，之后每隔28天注射一次，从兔子进行初次注射开始，经过4个月后获得的抗体。优选的，所述葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯巴比妥衍生物的制备包括以下步骤a、将15mg葡萄糖六磷酸脱氢酶溶解于12mLTris缓冲液中，然后依次加入225mg 还原型辅酶I、135mg葡萄糖-6-磷酸、0. 75mL卡必醇和2. 25mL 二甲基亚砜；所述Tris缓冲液PH为9. 0，各组分浓度为0. 05mol/LTris、3. 3mmol/L氯化镁，145. 4mmol/L氯化钠；b、苯巴比妥衍生物的活化将IOmg苯巴比妥衍生物溶解于420 μ L 二甲基亚砜和 180 μ L 二甲基甲酰胺中，加入6 μ L三丁胺和350 μ L氯甲酸异丁酯在2 8°C条件下搅拌 30分钟；C、将所述步骤a和b所得溶液混合，在2 8°C条件下搅拌12_16小时，并将偶联的酶标抗原进行G-25凝胶层析柱纯化，得到葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯巴比妥衍生物。本专利技术的有有益效果为本专利技术的苯巴比妥药物浓度均相酶免疫检测试剂盒准确度和精确度非常高，检测的标准差(SD)小于1.7%，血清标本的平均回收率(Recovery)大于95%，相关系数偏差(CV)小于2.5%。该试剂盒中提供的苯巴比妥抗体的特异性强，药物交叉反应试验中，对测试的30种常见药物和化合物几乎无任何交叉反应，适合临床检测苯巴比妥的血药浓度。本试剂盒的药物浓度的有效检测范围lOng-SOyg/mL，灵敏度达到 lOng/mL。本试剂盒简便、快速、成本低、灵敏度高、可全自动化。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明图1是苯巴比妥免疫检测试剂盒使用原理示意图2是苯巴比妥均相酶免疫测定的定标曲线。 具体实施例方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。本专利技术中的均相酶免疫测定是一种竞争性反应，该检测的基本原理是液体样本中游离的苯巴比妥与偶联在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-PhosphateDehydrogena se, G6PDH)上的苯巴比妥衍生物对特异性抗体的位点进行竞争结合。葡萄糖_6_磷酸脱氢酶-苯巴比妥衍生物偶联物是酶标半抗原，具有抗原和酶的活性，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶_苯巴比妥衍生物偶联物可以被抗体识别。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶既能够转化磷酸葡萄糖也能够将尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化成6-磷酸葡萄糖和还原型辅酶I (NADH)。这个过程导致吸光度的变化，可以在340nm波长光源下被检测到。一旦抗体与酶-苯巴比妥结合物结合上，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性即被抑制，液体样本中的苯巴比妥竞争性的取代与抗体结合的苯巴比妥酶偶联物，并使其从抗体的结合位点上释放出来，从而使葡萄糖-6-磷酸脱氢酶恢复活性。因此，液体样本中苯巴比妥的含量越多，游离的苯巴比妥衍生物_葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联物就越多，从而能得到更强的信号。请参阅图1苯巴比妥免疫检测试剂盒使用原理示意图。实施例一a、牛血清白蛋白_苯巴比妥衍生物免疫抗原的合成1、BSA溶液的制备，称取20mg牛血清白蛋白(BSA)并在室温条件下溶解于 5mL0. 2mol/L, pH8. 5的磷酸缓冲液中；2、苯巴比妥衍生物的活化，称取IOmg特异的苯巴比妥衍生物于小烧杯中，并依次加入350 μ L 二甲基酰胺(DMF)、350 μ L乙醇、700 μ L10mmol/L, ρΗ5本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种苯巴比妥均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：试剂Ｒ１：苯巴比妥衍生物特异的多克隆抗体；试剂Ｒ２：葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯巴比妥衍生物；试剂Ｒ３：定标液；所述定标液为苯巴比妥校准品溶于空白血清中制得；所述葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯巴比妥衍生物为苯巴比妥衍生物与葡萄糖六磷酸脱氢酶偶联产物，所述葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯巴比妥衍生物能与苯巴比妥衍生物特异抗体特异性结合；所述苯巴比妥衍生物特异的多克隆抗体是以苯巴比妥衍生物与牛血清白蛋白偶联的产物为免疫抗原制得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：虞留明，王金文，梁晓翠，李冬，胡朝晖，
申请(专利权)人：西安金域医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：87
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