一种快速检测样品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及检测方法，属于免疫学检测技术领域。本发明专利技术利用甲醛灭活的金黄色葡萄球菌免疫原免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体作为包被抗体，免疫BALB/C小鼠并进行细胞融合得到单克隆抗体作为二抗，建立了食品（牛奶）中金黄色葡萄球菌的双抗夹心酶联免疫法的试剂盒，为金黄色葡萄球菌在食品中的残留检测提供了快速高效的检测手段，费用较低并且稳定性和重复性较好。检测限为105cfu/mL，适合样品的大批量检测。
【技术实现步骤摘要】
一种快速检 测样品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及检测方法，属于免疫学检测
技术介绍
金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病的重要致病菌，该菌在自然界中广泛存在于空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中。人和动物均有较高的带菌率，健康人的咽喉、鼻腔、皮肤、头发等常带有产肠毒素(SE)的菌株，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。所以， 对金黄色葡萄球菌的快速、准确检验是保证人类健康的必要手段。传统的检测细菌的方法包括了生化培养、分离鉴定，检验程序复杂繁琐、报告检验结果大致需4 7d，耗时太长，而且检测灵敏度低。所以，建立快速而准确的检测方法一直是病原微生物检验研究的核心问题。免疫测定法，以其准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等特点，成为检验中广泛应用的方法之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速检测样品中金黄色葡萄球菌的试剂盒，以便可以简便，快速、灵敏地检测样品中的金黄色葡萄球菌，尤其适合各种样品的大批量检测本专利技术的技术方案利用市售的金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)作为免疫原免疫健康新西兰大白兔得到多克隆抗体作为包被抗体，免疫BALB/C小鼠并进行细胞融合得到单克隆抗体作为二抗，建立了食品中金黄色葡萄球菌的双抗夹心ELISA法的试剂盒。本专利技术的试剂盒由以下几部分组成(1)以0. 05M的碳酸盐缓冲溶液稀释的多克隆抗体，包被96孔酶标板中，每孔100 μ L。 4°C孵育过夜，按照常规ELISA方法封闭洗涤为试剂盒中的反应板。(2)金黄色葡萄球菌阳性对照标准品和阴性对照标准品。(3)以抗体稀释液稀释的单克隆抗体抗血清。(4)以抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(IgG-HRP)。(5)显色液A，显色液B，使用前将A与B以5:1体积混合。(6)终止液(2M硫酸溶液)。更详细的步骤为 主要溶液配制1)配制磷酸盐0. OlM(PBS)缓冲液 Na2HPO4 · 12H203. 62 gKH2PO40. 2 gNaCl0.2gKCl8. Og加超纯水稀释至1000 mL。2)配制碳酸盐0. 05Μ、ρΗ9· 6 (CB S)缓冲溶液 Na2CO31. 59gNaHCO32.93g加超纯水稀释至1000 mL。3)配制 PBST 溶液含 0. 05% Tween - 20 和 0. 15mol/L NaCl 的 PBS 溶液。4)配制封闭液含0. 1%明胶的包被缓冲液(0. OlM PBS缓冲液)。5)配制抗体稀释液含0. 1%明胶的PBST溶液。6)显色液A 液0. 933 g 柠檬酸，3. 68 g Na2HPO4 · 12H20,18 μ L 30%Η202，用超纯水定容至 100mL。B液60 mg 3，37, 5，57-四甲基联苯胺(TMB)溶于100 mL乙二醇中； 使用前将A与B以5 1体积混合。7)终止液2M WH2SO4。本专利技术所提供的检测试剂盒使用步骤如下预先配制 PBST 溶液(0. 01 mol/L pH7. 4，0. 15mol/L NaCl，0. 5%Tween_20)。a、分别在反应板内加入待测样品、阳性标准品、阴性标准品，100 μ L /孔，于37°C 温育Ih。b、洗涤用PBST洗涤反应板3-5次，每次3min，220 μ L/孔，然后甩干反应板。C、加入以抗体稀释液稀释的单克隆抗体抗血清，IOOuL /孔，37°C反应lh。d、洗涤用PBST洗涤反应板3-5次，每次3min，220 μ L/孔，然后甩干反应板。e、加酶标二抗(羊抗鼠 IgG-HRP )，100 μ L / 孔，37 C 反应 lh。f、洗涤用PBST洗涤反应板3-5次，每次3min，220 μ L/孔，然后甩干反应板。g、显色加显色液100 μ L /孔，显色15min。h、终止加终止液100 μ L /孔。i、测定用酶标仪检测OD45tlnm，即吸光值A450。当 > 2. 1，且 > 2. 1时，待测样品呈阳性；当 < 2. 1，且 > 2. 1时，待测样品呈阴性。本专利技术的有益效果本专利技术建立的金黄色葡萄球菌的双抗夹心ELISA检测方法， 对食品中的金黄色葡萄球菌进行检测，检测灵敏度为105cfu/mL。在4h内即可完成检测，可以快速准确完成检测，特别适合样品的大批量检测。具体实施方案 以下通过实施例进一步说明本专利技术。 实施例1.免疫原和阳性标准品的准备金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)接种在Baird-Parker平板上，37°C培养24h，挑取单菌落于10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤37°C、200r/min振荡培养17h，计数，用1%甲醛4°C过夜灭活，生理盐水调整浓度至5X 109cfu/mL，为免疫原；用PBS缓冲液调整浓度为107cfu/mL为阳性对照标准品，PBS缓冲液为阴性对照标准品。 实施例2.包被抗血清的制备1)实验动物选3只2月龄、体重为1. 5 - 2 kg的健康新西兰大白兔为实验动物。2)乳化将0. 5mL免疫原与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化， 直至将一滴乳剂滴入水中，不散开漂在水面上为止。3)免疫方法初次免疫将乳化好的试剂于兔子背部多点注射，1 mL/只。初次免疫后的免疫称为加强免疫，加强免疫用福氏不完全佐剂乳化，加强免疫为肌肉注射，每两周加强免疫一次，剂量与初次免疫相同。4)采血3次加强免疫后从耳缘静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价达到要求(1 128000)后，采用耳静脉放血与心脏放血相结合获得抗血清， 收集于50 mL灭菌塑料离心管中。5)抗体的纯化和保存将抗血清X mL用等量的生理盐水稀释至2X mL，然后在搅拌下逐滴加入与稀释后血清等量(2X)的饱和硫酸铵，4°C放置3小时使其充分沉淀。3000r/ min离心20min，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至X mL，再逐渐滴加饱和硫酸铵(X/2)mL。4°C 放置3小时使其充分沉淀，重复上述第二步过程1次，将末次离心后所得沉淀物以0. 02mol/ L PBS (pH 7.4)溶解至X mL，装入透析袋中0. 02mol/L PBS (pH 7.4)充分透析，期间换液3 次，透析完浓缩，用包被缓冲液稀释到3Pg/mL作为多克隆抗血清。实施例3.单克隆抗血清的制备1)实验动物选3只8周龄，体重20g左右、雌性BALB/C小鼠为实验动物。2)免疫方法每只小鼠腹腔注射0. 2mL免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。3)采血3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按常规方法进行细胞融合。4)细胞融合取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50% PEG作用下常规融合，分别接种于96孔培养板，置于37°C、5% CO2培养箱培养。5)杂交瘤细胞筛选采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞， 将其转移至24孔本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种金黄色葡萄球菌的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于利用甲醛灭活的金黄色葡萄球菌免疫原免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体作为包被抗体，免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠并进行细胞融合得到单克隆抗体作为二抗，建立了金黄色葡萄球菌的双抗夹心酶联免疫法的试剂盒；所述试剂盒由以下几部分组成：（１）以０．０５Ｍ的碳酸盐缓冲溶液稀释的多克隆抗体，包被９６孔酶标板中，每孔１００μＬ；４℃孵育过夜，按照常规ＥＬＩＳＡ方法封闭洗涤，为试剂盒中的反应板；（２）金黄色葡萄球菌阳性对照标准品；阴性对照标准品；金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ ２９２１３接种在Ｂａｉｒｄ－Ｐａｒｋｅｒ平板上，３７℃培养２４ｈ，挑取单菌落于１０％ 氯化钠胰酪胨大豆肉汤３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ振荡培养１７ｈ，计数，用１％甲醛４℃过夜灭活，生理盐水调整ＡＴＣＣ ２９２１３浓度至５×１０９ｃｆｕ／ｍＬ，为免疫原；用ＰＢＳ缓冲液调整ＡＴＣＣ ２９２１３浓度为１０７ｃｆｕ／ｍＬ为阳性对照标准品，ＰＢＳ缓冲液为阴性对照标准品；（３）以抗体稀释液稀释的单克隆抗体抗血清；抗体稀释液：含０．１％明胶的ＰＢＳＴ溶液；（４）以抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠ＩｇＧ－ＨＲＰ；（５）显色液Ａ：０．９３３ ｇ柠檬酸，３．６８ ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ，１８ μＬ ３０％Ｈ２Ｏ２，用超纯水定容至１００ ｍＬ；显色液Ｂ：６０ ｍｇ ３，３／，５，５／－四甲基联苯胺溶于１００ ｍＬ乙二醇中；使用前将Ａ与Ｂ以５：１体积混合；（６）终止液：２Ｍ 硫酸溶液。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王利兵，胥传来，勇倩倩，邓小芳，宋珊珊，张勋，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32
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