本发明专利技术涉及一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条及其制备方法，试纸条包括底板、硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫、样品垫和吸水垫。制备方法包括在底板上依次相互交错黏贴经预处理的硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫、经预处理的样品垫和吸水垫，即得同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条。本发明专利技术对两个丰度差异较大蛋白同时进行检测，为临床上心肌梗死的快速诊断提供了极大的便利，解决和弥补传统免疫试纸条技术灵敏度低，同时检测多蛋白时线性范围窄的缺陷；制备方法工艺简单，成本低，操作简便，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于cTnl和Myo的检测领域，特别涉及一种半定量同时检测cTnl和Myo 的免疫层析试纸条及其制备方法。
技术介绍
急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是心血管系统的急危重症， 发病率高，预后较差，死亡率高。早期快速的诊断对于该病及时治疗及预后具有重大意义， 是检验医学中一个重要的研究方向。在急性心肌梗死的早期诊断中，肌钙蛋白Kcardiac troponin I，cTnl)和肌血球素(myoglobin，Myo)的联合检测有着重要的诊断指导意义。 cTnl是存在于心肌细胞肌丝中的一种心肌调节蛋白，它是AMI发生时较为特异的一种蛋白。它在正常人血液中含量很低，约为20.4pg/ml。在AMI发生2. 2-6. 8小时，它的浓度开始升高，大约在11. 2小时达到峰值195. 9ng/ml。Myo是目前公认的检测早期心肌损伤的较好的指标之一，广泛存在于心肌和骨骼肌的横纹肌中，它在正常人血液中含量小于50ng/ ml，在AMI发病2-3小时后浓度开始升高，9_12小时达到峰值，24-36小时后恢复正常。虽然不是心肌损伤特异的标志蛋白，但是近来的研究表明，在心肌梗死发生早期(5小时内)， 它与cTnl联合检测使AMI诊断的灵敏度、特异性得到了最佳体现，明显优于肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、C反应蛋白(CRP)和脑钠尿多肽(BNP)等指标。目前临床上检测血液中蛋白的方法主要有放射免疫分析法(Radioimmunoassay， RIA)，生化免疫分析法，醇联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)禾口免疫荧光法(immunofluorescence，IF)等。但这些方法都有一定的局限性RIA的优点是结果精确，线性范围宽，缺陷是操作过程复杂，样品处理耗时，同时，放射性标记会对操作者造成伤害并对环境造成污染；生化免疫分析法虽已被广泛应用，但其检测灵敏度较差；ELISA则由于方法间差异较大，导致结果不均一，且线性范围较窄，此外，因为其操作复杂，不适于做单人份或少量标本的检测；IF中荧光强度随PH值和荧光燃料与抗体的比例而改变，难以定量反映抗原-抗体的结合。因此建立简单、特异、快速、便捷的多蛋白检测方法就显得尤为重要，这不仅能降低病人的诊断费用，更重要的是能够节省时间，从而尽快对病人开展治疗。近年来，试纸条检测技术的发展为生化以及医学快速检测蛋白提供便捷的途径。 然而临床医学中现有的试纸条法多采用单蛋白的检测方式，不仅增加检测成本，更浪费检测样品；同时，由于检测灵敏度低(通常为lng/ml)，难以对疾病早期的一些微量蛋白标志物进行检测，也很难同时检测两种丰度差异较大的蛋白，从而最终延误治疗时间。目前，提高灵敏度不是通过对样品预先处理(延长检测时间)，就是使用荧光技术(需要额外荧光检测仪)来实现。生物素-链亲和素系统(biotin-str印tavidin system, BSS)是70年代后期开始广泛应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与链亲和素之间高度亲和力及多级放大效应，并与胶体金、荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合于一体，使各种免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。BSS已经广泛应用于生物医学实验和研究的各个领域，用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究。但目前在试纸条上的应用也是结合荧光技术，不仅增加了检测成本，还需要额外的荧光检测仪。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种半定量同时检测cTnl和Myo的免疫层析试纸条及其制备方法，该试纸条对两个丰度差异较大蛋白同时进行检测，为临床上心肌梗死的快速诊断提供了极大的便利，解决和弥补传统免疫试纸条技术灵敏度低，同时检测多蛋白时线性范围窄的缺陷。本专利技术的一种半定量同时检测cTnl和Myo的免疫层析试纸条，包括底板、硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫、样品垫和吸水垫，其特征在于硝酸纤维素膜上预包被有心肌肌钙蛋白I cTnl包被抗体(检测线，Tl)、肌血球素Myo包被抗体(检测线，T2)和羊抗鼠IgG (质控线，Cl)，第一结合垫预包被有cTnl捕获抗体胶体金探针CTnI-AuNP和Myo 捕获抗体纳米金探针Myo-AuNP，胶体金探针结合有生物素化的DNA，第二结合垫预包被有链亲和素纳米金探针SA-AuNP。本专利技术的一种半定量同时检测cTnl和Myo的免疫层析试纸条的制备方法，包括(1)将样品垫(SK06，金标公司)置于样品垫处理液中浸泡后干燥，即得经预处理的样品垫；(2)将结合垫(VL68，金标公司)置于结合垫处理液中浸泡后干燥，再将体积比为 1 1的CTnI-AuNP和Myo-AuNP的溶液喷印于结合垫上，得第一结合垫；将SA-AuNP溶液喷印于结合垫上，得第二结合垫；(3)使用PBS溶液，将cTnl包被抗体、Myo包被抗体和羊抗鼠IgG浓度调整为Img/ ml，然后分别将上述lmg/ml的物质喷印于硝酸纤维素膜(Hi-Flow Plus 180，Millipore) 上，即得经预处理的硝酸纤维素膜；(4)在底板上的一侧依次相互交错黏贴经预处理的硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫、经预处理的样品垫，另一侧黏贴吸水垫(CH37K，金标公司)，即得同时检测cTnl 和Myo的免疫层析试纸条。所述步骤(1)中的样品垫处理液为含质量百分比牛血清白蛋白(BSA)、0. 05% Tween-20和0. 05%叠氮钠的IOmM PBS溶液。所述步骤O)中的结合垫处理液为质量百分比浓度为5%的蔗糖溶液。所述步骤(1)和⑵中浸泡时间为30 60min，干燥温度为37 45°C，干燥时间为12 18小时。所述步骤⑵中的cTnl-AuNP溶液由在直径13nm的纳米金溶液中加入cTnl捕获抗体和生物素化的单链DNA，并保存于Tris-HCl缓冲溶液制得。所述步骤(2)中的Myo-AuNP溶液由在直径41nm的纳米金溶液中加入Myo捕获抗体，并保存于Tris-HCl缓冲溶液制得。所述步骤O)中的链亲和素纳米金探针溶液由在直径41nm的纳米金溶液中加入链亲和素，并保存于Tris-HCl缓冲溶液制得。所述Tris-HCl缓冲溶液含质量百分比5 %的聚乙烯吡咯烷酮、1. 25 %的蔗糖、 0. 05%的聚乙二醇8000,0. 2%的牛血清白蛋白和0. 05%的Tween-20 本专利技术所采用的cTnl和Myo包被和捕获抗体均为单克隆技术制备的抗体。利用抗原抗体结合原理，当待检样品中含有Myo抗原时，Myo抗原和Myo捕获抗体会发生结合， 然后通过毛细管层析作用，向前移动到Myo包被抗体位置，Myo抗原会再次和Myo包被抗体结合，以“三明治”形式形成双抗夹心复合物而聚集于Tl线上显示红色条带，而未结合的 Myo捕获抗体则会继续前行，到达质控线处，与羊抗鼠IgG结合，从而在Cl处聚集显示红色条带。当待检样品中含有cTnl抗原时，cTnl抗原和cTnl捕获抗体会发生结合，然后通过毛细管层析作用，向前移动到相应的cTnl包被抗体位置，cTnl抗原会再次和cTnl包被抗体结合，以“三明治”形式形成双抗夹本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种半定量同时检测ｃＴｎＩ和Ｍｙｏ的免疫层析试纸条，包括底板、硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫、样品垫和吸水垫，其特征在于：硝酸纤维素膜上预包被有心肌肌钙蛋白Ｉ ｃＴｎＩ包被抗体、肌血球素Ｍｙｏ包被抗体和羊抗鼠ＩｇＧ，第一结合垫预包被有ｃＴｎＩ捕获抗体胶体金探针ｃＴｎＩ－ＡｕＮＰ和Ｍｙｏ捕获抗体纳米金探针Ｍｙｏ－ＡｕＮＰ，胶体金探针结合有生物素化的ＤＮＡ，第二结合垫预包被有链亲和素纳米金探针ＳＡ－ＡｕＮＰ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：毛红菊，祝继敏，金庆辉，赵建龙，朱大年，
申请(专利权)人：中国科学院上海微系统与信息技术研究所，
类型：发明
国别省市：31
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