甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒技术

本发明专利技术涉及利用二倍扩增法、酶比色法及酶联法技术的甘氨酸含量的测定方法、试剂的组成及成分，其测定的技术原理是依据氰化氢合成酶、丙酮酸合成酶、辅酶A-谷胱甘肽还原酶的系列催化反应完成，本发明专利技术还涉及一种甘氨酸测定试剂盒。本发明专利技术的测定方法灵敏度高、误差小，因此本发明专利技术的测定方法与试剂盒可以广泛地应用于食品检验。

【技术实现步骤摘要】
甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒
本专利技术涉及食品检验测定
，更具体地，本专利技术涉及甘氨酸测定方法及其试齐U盒。
技术介绍
甘氨酸为非人体必需氨基酸。甘氨酸有独特的甜味，能缓和酸、碱味，掩盖食品中添加糖精的苦味并增强甜味。人体若摄入甘氨酸的量过多，不仅不能被人体吸收利用，而且会打破人体对氨基酸的吸收平衡而影响其它氨基酸的吸收，导致营养失衡而影响健康。甘氨酸不能被人体利用，只能分解转化为热能，这样会增加肝脏负担。而分解产物中的含氮化合物要通过尿液排出体外，又会增加肾脏负担。如果大量、长期食用这类食品，可能造成肝肾损伤。部分含乳饮料企业为提高产品中蛋白质含量，在生产加工中违规使用甘氨酸，对青少年及儿童的正常生长发育很容易带来不利影响。按照我国《食品添加剂使用卫生标准》GB2760规定，甘氨酸在作为食品添加剂只允许在调味剂与豆奶中使用，且最高限量为每公斤1克，但在含乳饮料中不允许使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种甘氨酸的测定方法。本专利技术的另一个目的是提供一种甘氨酸测定试剂盒。本专利技术是通过下述技术方案实现的。本专利技术的方法是一种采用二倍扩增法、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶(偶)联法(Couple Reaction)的联用技术，利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处的吸光度变化测定甘氨酸的方法。本专利技术甘氨酸测定方法的的技术原理是根据下述氰化氢合成酶、丙酮酸合成酶、 辅酶A-谷胱甘肽还原酶的系列催化反应完成 甘氨酸+2辅酶氰化氢合成酶氰化氢+ 二氧化碳+2还原型辅酶二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型铁氧还蛋白丙酮酸合成酶丙酮酸+辅酶A+氧化型铁氧还蛋白辅酶A+谷胱甘肽+辅酶辅酶A-谷胱甘肽还原酶辅酶A-谷胱甘肽+还原型辅酶本专利技术的方法利用氰化氢合成酶(hydrogen cyanide synthase ；EC 1.4.99.5) 酶(偶)联丙酮酸合成酶(pyruvate synthase ；EC 1. 2. 7. 1)、辅酶Α-谷胱甘肽还原酶 (CoA-glutathione reductase ；EC 1. 8. 1. 10)酶促反应终点法。氰化氢合成酶酶解甘氨酸反应产生二氧化碳，再通过(偶)联合丙酮酸合成酶、辅酶A-谷胱甘肽还原酶的作用，最终将辅酶(在MOnm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，这样可以通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算甘氨酸的浓度大小。本专利技术是通过下述技术方案实现的。本专利技术涉及一种甘氨酸的测定方法。该甘氨酸测定方法的步骤如下A、样品准备A. 1标准样品的制备将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中，再将甘氨酸浓度调整到1毫摩尔/升，得到的溶液作为标准样品；A. 2待测样品的制备待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；A. 3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其甘氨酸浓度为0毫摩尔/升；B、试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、辅酶、氰化氢合成酶、丙酮酸合成酶、辅酶A-谷胱甘肽还原酶、乙酰辅酶A、还原型铁氧还蛋白与谷胱甘肽，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、0. l-5mmol/ L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 与 l-100mmol/L ；C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化；E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)空白样品的吸光度随时间的变化；F、数据处理由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到甘氨酸的含量权利要求1.一种利用二倍扩增法、酶比色法及酶联法技术的甘氨酸浓度测定方法，其测定的技术原理是根据下述氰化氢合成酶、丙酮酸合成酶、辅酶A-谷胱甘肽还原酶的系列催化反应完成甘氨酸+2辅酶氰化氢合成酶氰化氢+ 二氧化碳+2还原型辅酶二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型铁氧还蛋白丙酮酸合成酶丙酮酸+辅酶A+氧化型铁氧还蛋白辅酶A+谷胱甘肽+辅酶辅酶A-谷胱甘肽还原酶辅酶A-谷胱甘肽+还原型辅酶2.一种甘氨酸的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下 2. 1样品准备2. 1. 1标准样品的制备将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中，再将其浓度调整到1毫摩尔/升； 2. 1.2待测样品的制备待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中； 2. 1.3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其甘氨酸浓度为0毫摩尔/升； 2. 2试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、辅酶、氰化氢合成酶、丙酮酸合成酶、辅酶A-谷胱甘肽还原酶、乙酰辅酶A、还原型铁氧还蛋白与谷胱甘肽，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、0. l-5mmol/ L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 与 l-100mmol/L ；2. 3待测样品与在步骤2. 2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制，可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；2. 4在与步骤2. 3)同样的条件下测定步骤2. 1. 1)标准样品的吸光度随时间的变化； 2. 5在与步骤2. 3)同样的条件下测定在步骤2. 1. 3)使用的水或缓冲液作为空白溶液的吸光度随时间的变化；2.6数据处理由步骤2. 3-2. 5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到甘氨酸的含量3.根据权利要求1、2所述的测定方法，其特征在于使用全自动生化分析仪测定时，待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条 件下进行測定測定方法为终点法，温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副 波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为正反应，延迟时 间1/0分钟，检测时间4/5分钟。4.根据权利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在干，所述的稳定剂是ー种或多种 选自硫酸铵、氯化钠、乙ニ醇、丙ニ醇、甘油或双乙酸钠、叠氮钠等防腐剂的稳定剂；所述的 缓冲液是ー种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸 缓冲液、磷酸氢ニ钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼 砂缓冲液、ニ乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液；所述的辅酶是一本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种利用二倍扩增法、酶比色法及酶联法技术的甘氨酸浓度测定方法，其测定的技术原理是根据下述氰化氢合成酶、丙酮酸合成酶、辅酶Ａ－谷胱甘肽还原酶的系列催化反应完成：甘氨酸＋２辅酶氰化氢合成酶氰化氢＋二氧化碳＋２还原型辅酶二氧化碳＋乙酰辅酶Ａ＋还原型铁氧还蛋白丙酮酸合成酶丙酮酸＋辅酶Ａ＋氧化型铁氧还蛋白辅酶Ａ＋谷胱甘肽＋辅酶辅酶Ａ－谷胱甘肽还原酶辅酶Ａ－谷胱甘肽＋还原型辅酶

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32