甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒技术

本发明专利技术涉及利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的甘氨酸含量的测定方法、试剂的组成及成分，其测定的技术原理是依据甘氨酸转氨酶、氨甲酰磷酸合成酶、氰化氢合成酶的系列催化反应完成，本发明专利技术还涉及一种甘氨酸测定试剂盒。本发明专利技术的测定方法灵敏度高、误差小，因此本发明专利技术的测定方法与试剂盒可以广泛地应用于食品检验。

【技术实现步骤摘要】
甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒
本专利技术涉及食品检验测定
，更具体地，本专利技术涉及甘氨酸测定方法及其试齐U盒。
技术介绍
甘氨酸为非人体必需氨基酸。甘氨酸有独特的甜味，能缓和酸、碱味，掩盖食品中添加糖精的苦味并增强甜味。人体若摄入甘氨酸的量过多，不仅不能被人体吸收利用，而且会打破人体对氨基酸的吸收平衡而影响其它氨基酸的吸收，导致营养失衡而影响健康。甘氨酸不能被人体利用，只能分解转化为热能，这样会增加肝脏负担。而分解产物中的含氮化合物要通过尿液排出体外，又会增加肾脏负担。如果大量、长期食用这类食品，可能造成肝肾损伤。部分含乳饮料企业为提高产品中蛋白质含量，在生产加工中违规使用甘氨酸，对青少年及儿童的正常生长发育很容易带来不利影响。按照我国《食品添加剂使用卫生标准》GB2760规定，甘氨酸在作为食品添加剂只允许在调味剂与豆奶中使用，且最高限量为每公斤1克，但在含乳饮料中不允许使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种甘氨酸的测定方法。本专利技术的另一个目的是提供一种甘氨酸测定试剂盒。本专利技术是通过下述技术方案实现的。本专利技术的方法是一种采用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶(偶)联法(Couple Reaction)的联用技术， 利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处的吸光度变化测定甘氨酸的方法。本专利技术甘氨酸测定方法的的技术原理是根据下述甘氨酸转氨酶、氨甲酰磷酸合成酶、氰化氢合成酶的系列催化反应完成 甘氨酸+酮戊二酸甘氨酸转氨酶乙醛酸+谷氨酸谷氨酸+2腺苷二磷酸+磷酸根+氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸合成酶2腺苷三磷酸+谷氨酰胺+ 二氧化碳+水二氧化碳+氰化氢+2还原型辅酶氰化氢合成酶甘氨酸+2辅酶本专利技术的方法利用甘氨酸转氨酶(glycine transaminase ；EC 2. 6. 1· 4)酶(偶) 联氨甲酰磷酸合成酶(carbamyl phosphate synthetase ；EC 6. 3. 5. 5)、氰化氢合成酶 (hydrogen cyanide synthase ；EC 1.4.99.5)酶促反应连续监测法。甘氨酸转氨酶、氨甲酰磷酸合成酶作为作用酶，甘氨酸转氨酶功能为将甘氨酸酶解产生谷氨酸，氨甲酰磷酸合成酶的酶促作用使谷氨酸产生二氧化碳；氰化氢合成酶作为循环酶氰化氢合成酶将二氧化碳再次变回甘氨酸，使甘氨酸不断地被重复循环利用。氰化氢合成酶又作为显色酶，将还原型辅酶(在MOnm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，这样可以通过测量340nm处吸光度下降的速度， 可以测算甘氨酸的浓度大小。本专利技术是通过下述技术方案实现的。本专利技术涉及一种甘氨酸的测定方法。该甘氨酸测定方法的步骤如下A、样品准备A. 1标准样品的制备将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中，再将甘氨酸浓度调整到1毫摩尔/升，得到的溶液作为标准样品；A. 2待测样品的制备待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；A. 3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其甘氨酸浓度为0毫摩尔/升；B、试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、甘氨酸转氨酶、氨甲酰磷酸合成酶、 氰化氢合成酶、酮戊二酸、腺苷二磷酸、单价磷酸盐、氨甲酰磷酸与氰化氢，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0. 001-7mol/ L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、 l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 与 l-lOOmmol/L ；C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化；E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)空白样品的吸光度随时间的变化；F、数据处理由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到甘氨酸的含量ΔΑ (样品)-ΔΑ (空白)甘氨酸含量=-^标准浓度(mmol/L)ΔΑ (标准)-ΔΑ (空白)式中Δ A(样品)表示步骤C)得到的待测样品的吸光度变化；Δ A(空白)表示步骤Ε)得到的空白样品的吸光度变化；Δ A (标准)表示步骤D)标准样品的吸光度变化。根据本专利技术，在所述的甘氨酸测定方法中，所述的缓冲液应该理解是能够使其测定介质的PH基本保持稳定(一般是6. 5-8. 5)的溶液。如果该ρΗ高于8. 5或ρΗ低于6. 5，则该测定方法使用的酶的活性达不到预期的活性效果，因此需要添加更多的介质与酶，才有可能达到预期的活性效果。在本专利技术中，所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液。优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、 磷酸盐缓冲液或“PBS”缓冲液。更优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液或磷酸盐缓冲液。根据本专利技术，在所述的甘氨酸测定方法中，所述的稳定剂应该理解是一种能保护试剂中的介质(底物)与酶，使其不会随着时间推移而改变其性质，进而失去活性的物质， 它会使得试剂具备很长的活性寿命，通常长达数月，甚至一、二年。如果没有所述的稳定剂， 则试剂的活性在溶液中只能维持数十小时，顶多数天，就会逐渐失去活性而不再具备检测性能。在本专利技术中，所述的稳定剂使用量是0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不够， 则试剂活性的寿命就会缩短；如果所述的稳定剂使用量过高，则会增加成本。在本专利技术中，所述的稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠的稳定剂。更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油、硫酸铵或双乙酸钠的稳定剂。在本专利技术中，所述的还原型辅酶是一种或多种选自NADPH、NADH或thio_NADH的还原型辅酶。根据一种本专利技术的优选实施方式，本专利技术使用全自动生化分析仪测定甘氨酸时， 待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下(参数)自动取样，然后在下述条件下进行测定测定方法为速率法或二点终点法，温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为负反应，延迟时间1/0分钟，检测时间4/5分钟。根据另一种本专利技术的优选实施方式，本专利技术使用的试剂溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的甘氨酸浓度测定方法，其测定的技术原理是根据下述甘氨酸转氨酶、氨甲酰磷酸合成酶、氰化氢合成酶的系列催化反应完成：甘氨酸＋酮戊二酸　　甘氨酸转氨酶　　乙醛酸＋谷氨酸谷氨酸＋２腺苷二磷酸＋磷酸根＋氨甲酰磷酸　　氨甲酰磷酸合成酶２腺苷三磷酸＋谷氨酰胺＋二氧化碳＋水二氧化碳＋氰化氢＋２还原型辅酶　　氰化氢合成酶　　甘氨酸＋２辅酶

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32