一种用于细菌诊断的核苷酸序列及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种核苷酸序列及所述核苷酸序列在细菌鉴别诊断中的应用，本发明专利技术所提供的探针序列及检测方法可以快速、特异、灵敏地检测类志贺邻单胞菌，有效地避免了其它细菌，特别是肠出血性大肠杆菌的非特异性扩增。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及TaqMan探针在细菌检测中的应用，特别是在类志贺邻单胞菌鉴别诊断中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。
技术介绍
类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)呈世界性分布。淡水水源和江河水生态环境是类志贺邻单胞菌的主要储存地，鱼类是类志贺邻单胞菌常见的宿主。过去认为该菌对人的致病性不强，是鱼类等水生动物重要的致病菌。最近几年由该菌引起的婴幼儿、老年人以及免疫功能不全病人的胃肠道感染病例逐渐增加，是人类肠炎的主要病因，世界各地屡有报道。类志贺邻单胞菌亦可引起人类菌血症、蜂窝组织炎、脑膜炎等肠外感染， 该菌亦与旅行者腹泻密切相关。类志贺邻单胞菌是一种革兰氏阴性、能运动、兼性厌氧、氧化酶阳性的非孢子繁殖的细菌，1947年首次从腹泻病人粪便中分离出来。类志贺邻单胞菌是邻单胞菌属中唯一的一个种，其分类归属地位复杂。该菌曾与对人类致病的弧菌属和气单胞菌属一起归属于弧菌科，后研究发现其在分子水平跟类志贺邻单胞菌和变形杆菌属更为接近，在2005年第二版《系统细菌学伯杰氏手册》中，类志贺邻单胞菌才被确立为肠杆菌科，邻单胞菌属。作为肠杆菌科病原菌，国内外已有过多起关于该菌引起的感染性腹泻和食物中毒的报道，可认为是一种新的引起人类腹泻的重要肠道病原菌。来自日本的一项研究发现在 1994至1996年间所有引起旅行者腹泻的肠杆菌中，类志贺邻单胞菌位居第一(66. 7% )。在日常感染性腹泻病原菌监测过程中，对类志贺邻单胞菌的检测较少，在粪便样本的常规培养中往往将其忽略，并且该菌缺少特异的筛选培养基，在一些肠道培养基上形成的菌落性状与嗜水气单胞相似，难以区别，这也影响了类志贺邻单胞菌的分离率。类志贺邻单胞菌的传统检测方法需要进行选择性增菌、多种培养基筛选鉴定，整套操作步骤繁多， 耗时至少6-7天，且检测结果容易受到操作人员经验丰富与否的影响。通过序列比对我们发现类志贺邻单胞菌的23S rRNA基因的5'端区域的核酸序列变异度高，可以将类志贺邻单胞菌与其他密切相近的菌属例如变形杆菌属、弧菌属以及气单胞菌属区分开来。最近，一些学者采用聚合酶链式反应(PCR)的方法对该区域的基因组DNA进行扩增检测，虽然这种方法可以节省大量的时间并使整个操作变得简单，但是这种方法在实际应用中存在不可避免的弊端。例如灵敏度低，容易对含菌量低的标本发生漏检；还有特异性差，有学者发现含有stx2基因的大肠杆菌在用该方法进行扩增时也会产生一个大小类似的扩增条带，影响了类志贺邻单胞菌的鉴定。因此在本
需要建立一种针对类志贺邻单胞菌的高特异性，特别是能够鉴别诊断肠出血性大肠杆菌的检测方法。最近几年，实时荧光TaqMan PCR技术(real time TaqMan PCR, TaciMan是罗氏公司(Roche Molecular System, Inc.)的注册商标)广泛的应用于病原体微生物的检测，普通PCR方法只能将产物从大小上进行区分，实时荧光TaqMan PCR技术在普通PCR的基础上又加入一条特异的荧光探针，并且该技术对引物与模板的同源性要求也高于普通PCR。实时荧光TaqMan PCR中的探针序列必须与目标序列完全匹配，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭剂则在3'末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；但在 PCR扩增时，随着引物的延伸Taq酶的5' -3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此比普通PCR法具有更高的特异性。但是在荧光TaqMan PCR技术的应用中，探针的选择是一个重要因素， 因为其涉及到与引物的匹配，以及最关键的检测特异性的问题。在本专利技术中，我们针对类志贺邻单胞菌的23S rRNA基因的5'端上下游引物之间的保守序列设计了一条TaqMan探针， 旨在建立一种针对该病原菌的灵敏、特异、快速的核酸检测体系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种应用能够应用于细菌检测，特别是荧光TaqMan PCR技术的检测探针序列，更进一步提供荧光TaqMan PCR技术检测类志贺邻单胞菌方法，以及用于该方法的试剂盒。基于以上目的，专利技术人对NCBI上所有的类志贺邻单胞菌核酸序列进行比对，发现该致病菌23S rRNA基因(X65487. 1，Plesiomonas shigelloides)的5'端区域核酸序列特异性好，可以将类志贺邻单胞菌与其他密切相近的菌属例如变形杆菌属、弧菌属以及气单胞菌属区分开来。专利技术人在该区域使用引物探针设计软件Primer Express〗.O (ABI)设计引物探针，并将获得的特异性引物和探针在NCBI数据库中进行比对分析，以排除引物-探针与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的引物_探针序列。本专利技术首先提供了一种用于细菌检测的探针序列，所述序列含有如SEQ ID NO 3 所示的序列。序列选自于X65487. 1中的第1111到1132位核苷酸.优选地，所述序列为SEQ ID NO 3所示。其次，本专利技术提供了一种荧光TaqMan PCR检测方法，所述方法包括(1)被检测物种的基因组DNA的抽提；(2)以步骤⑴获得的DNA为模板进行TaqMan PCR扩增，其中上游引物为SEQ ID NO 1所示的序列，下游引物为SEQ ID NO 2所示的序列，探针序列为SEQ ID NO 3 ；(3)对扩增结果进行检测分析。上述SEQ ID NO :1 选自于 X65487. 1 中的第 1165 到 1189 位核苷酸，SEQ ID NO 2 选自于X65487. 1中的第906到930位核苷酸。优选地，步骤(2)的PCR反应条件为优选地，所述步骤(2)和(3)在ABI 7500Fast实时荧光定量PCR仪中进行。在上述方法中，所述物种优选为细菌。更为优选地，所述细菌选自下述细菌肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠聚集性大肠杆菌95 0C 30s 95 0C5s60 °C 34s4(EaggEC)、尿路致病性大肠杆菌(UPEC)、福氏志贺菌、宋内志贺菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、 副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、血链球菌、唾液链球菌、牛链球菌、 粪肠球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌。更为优选地，所述细菌为类志贺邻单胞菌。更为优选地，所述细菌为肠出血性大肠杆菌。最后，本专利技术还提供了一种用于细菌检测的TaqMan PCR试剂盒，所述试剂盒包括(1)热启动Taq DNA聚合酶；(2)实时荧光定量PCR缓冲液；(3)序列为SEQ ID NO 1的上游引物为和序列为SEQ ID NO 2的下游引物；(4)序列为 SEQ ID NO 3 的探针。本专利技术建立的实时荧光TaqMan PCR方法是首次将荧光探针运用到了类志贺邻单胞菌的检测，与普通PCR相比，实时荧光TaqMan PCR方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于细菌检测的探针序列，所述序列含有如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３所示的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孟双，徐建国，叶长芸，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：11