一种桑色素-7-硫酸酯钠抑制PRL-3酶活性及在抗肿瘤转移药物中的应用，用基因工程技术得到具有酶活性的人PRL-3蛋白，筛选得到一种水溶性的桑色素-7-硫酸酯钠对PRL-3酶活性具有明显的抑制作用，抑制效果大大强于其母体桑色素，也优于其它化合物或天然产物，Transwell小室法测定结果表明该化合物能明显抑制肿瘤细胞的体外侵袭和运动能力，Western?blot和荧光定量PCR结果显示该化合物能特异性抑制PRL-3蛋白和mRNA表达，而不抑制PRL-3同家族成员PRL-1和PRL-2蛋白和mRNA的表达。本发明专利技术提供的该化合物对PRL-3在肿瘤转移中的作用研究以及抗肿瘤转移药物的设计与研发具有很高的应用价值，可应用于制备PRL-3酶抑制剂的阳性对照试剂或化合物，以及在药物开发中作为其中一个组分或前体用于制备抗肿瘤转移药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于一种桑色素-7-硫酸酯钠抑制PRL-3酶活性及在抗肿瘤转移药物中的应用。
技术介绍
ISHTifflSIBI-3 (phosphatase of regenerating liver-3, PRL-3) 子蛋白酪氨酸磷酸酶，新近发现其与肿瘤转移密切相关。目前PRL-3与肿瘤转移的关系已经十分明确。PRL-3基因最初被发现在人结直肠黏膜上皮细胞和结直肠原发癌细胞中低表达，而在淋巴结、肺和肝等转移灶中持续高表达， 提示PRL-3基因与结直肠癌的转移密切相关，其后众多研究还表明PRL-3高表达与人胃癌、 食管癌、鼻咽癌、SKNAS成神经细胞瘤、乳腺癌和黑色素瘤转移有关，且raL-3高表达的癌症患者预后情况远差于PRL-3低表达患者。另外体内和体外实验也表明高表达PRL-3与肿瘤转移生物学行为相关。同时国内外对PRL-3相互作用蛋白和PRL-3在肿瘤转移中的信号转导途径已进行了较深入的研究。Peng L等通过酵母双杂交系统发现PRL-3能与整合素结合并通过ERK1/2 和MMP-2信号途径促进结肠癌的侵袭转移能力，Ming J等研究报道PRL-3能通过上调ERK 磷酸化水平并激活Mio-A/C活性促进肺癌细胞的血管生成和转移能力；Wang L报道姜黄素能通过抑制Src磷酸化而下调PRL-3的表达，从而抑制黑色素瘤细胞的转移相关能力。因此&叫Q等提出PRL-3在筛选抗肿瘤转移药物方面是一个具有吸引力的分子靶点，其抑制剂研究具有巨大的临床应用价值。韩国学者Ahn JH通过化学合成方法得到多种罗丹宁衍生物，发现2个具有一定抑制作用的PRL-3抑制剂。Moon MK从红藤仔草中分离得到的2-甲基-1，3，6-三羟基-8，9 蒽醌对PRL-3酶也具有较好的抑制作用，IC50为1. 3 μ g/ml。我们对桑色素进行结构改造， 分离得到了水溶性的桑色素-7-硫酸酯钠，对PRL-3酶具有很好的抑制作用，IC5tl值达到 0. 94 μ mol/L,并抑制肿瘤细胞体外侵袭和运动能力。经检索发现，目前暂无桑色素-7-硫酸酯钠抑制PRL-3酶活性及抑制肿瘤细胞体外转移相关能力的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种桑色素-7-硫酸酯钠抑制PRL-3酶活性及在抗肿瘤转移药物中的应用，本专利技术应用基因工程技术得到具有酶活性的人PRL-3蛋白，通过PRL-3 酶抑制剂筛选模型，筛选得到一种半合成的桑色素-7-硫酸酯钠对PRL-3酶活性的具有明显的抑制作用，IC50值为0.94 μ mol/L，抑制效果大大强于其母体桑色素，也优于国外研究报道的其它化合物或天然产物，同时Transwell小室法测定结果表明桑色素_7_硫酸酯钠也能抑制肿瘤细胞的体外侵袭和运动能力，Western blot和荧光定量PCR结果显示桑色素-7-硫酸酯钠能特异性抑制PRL-3蛋白和mRNA表达，而不抑制PRL-3同家族成员PRL-I 和PRL-2蛋白和mRNA的表达。为实现上述专利技术目的，本专利技术采取的技术方案是通过基因工程技术得到具有酶活性的人PRL-3蛋白，通过测定PRL-3酶水解底物DiFMUP中磷酸基团生成DiFMU的荧光强度，计算桑色素-7-硫酸酯钠对PRL-3酶活性的抑制作用，并采用半数效量概率单位法计算其IC50值，然后通过Transwell小室法测定桑色素_7_硫酸酯钠抑制肿瘤细胞的体外转移能力，Western blot和荧光定量PCR分析桑色素-7-硫酸酯钠对PRL-3表达的影响，可应用于制备PRL-3酶抑制剂的阳性对照试剂或化合物，以及在药物中，作为其中一个组分或前体用于制备抗肿瘤转移药物。具体实施例方式实施例11.人PRL-3蛋白的表达、纯化与酶动力学分析根据Genebank公布的NM_03261 编码序列，应用生物学信息软件设计PRL-3特异性上下游引物，以人卵巢癌细胞总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，将回收纯化的PRL-3cDNA片段和pCold II质粒用限制性内切酶 BamHI和HindIII双酶切，将线性化的载体与目的片段按1 3的摩尔比混合，用T4DNA连接酶于16°C连接过夜，取适量连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细菌，随机挑选Amp抗性菌落扩增后碱裂解法小量提取质粒，酶切鉴定重组质粒pColdII-His-PRL-3，将鉴定无误的重组质粒pCold II-His-PRL-3转化人ArcticExpress E. coli后，以含Amp的LB培养液、37°C 220rpm振荡培养至0D600值达到约0. 4 0. 5，15°C保存30min，加入终浓度为0. 5mmol/L的IPTG进行诱导，15°C培养Mh，离心收菌，细菌裂解液裂解，取上清液进行 SDS-PAGE电泳和Western Blot以分析目的蛋白，在证实目的蛋白表达后，对上清液进行针对His-tag的M-NTA亲和纯化回收，然后进行酶活性分析，结果表明纯化的PRL-3蛋白具有磷酸酶活性。2.桑色素-7-硫酸酯钠对PRL-3酶活性的影响参照EnzChek Phosphatase Assay Kit(E12020)说明书进行。加入 8ymol/L DiFMUP (缓冲体系20mmol/L Tris-HCl, PH 8. 0,5mmol/L DTT,0. 01% Triton X-100 和 2mmol/LEDTA2Na) 100 μ 1 作为酶反应底物于96孔酶标板中，再加入不同浓度的桑色素-7-硫酸酯钠2 μ 1至终浓度为0. 625，1. 25， 2. 5，5，10和20 μ mol/L,再加入4. 0 μ gPRL-3酶100 μ 1，充分混勻，室温避光反应5min,用 0. 5mo VLNa3VO4抑制剂2 μ 1终止反应。Varioskan Flash扫描式多功能读数仪测定每孔中PRL-3酶水解底物DiFMUP中磷酸基团生成DiFMU的荧光强度(激发波长和发射波长分别为358nm和455nm)。结果显示桑色素_7_硫酸酯钠能明显抑制PRL-3酶活性，IC50值为 0. 94ymol/L。3.桑色素-7-硫酸酯钠对高转移卵巢癌细胞H0-8910PM细胞运动能力的影响 Transwell小室PVPF膜下表面涂纤粘蛋白Fibronectin 5 μ g，上室加含BSA的无血清培养基0. 5ml，下室加入0. 6ml含1 % BSA的RPMI-1640培养基，然后加入1 X IO5个细胞于上室中，再分别加入不同浓度桑色素-7-硫酸酯钠1 μ 1，使其终浓度分别为10、20和 4(^11101/1，对照组加入等量的？85。37°C>5% CO2温箱内孵育6h。^Transwell小室取出， 滤膜用甲醇固定，苏木精染色，水洗，伊红染色，水洗，用PBS浸湿的棉签擦去滤膜内表面的细胞；用封片胶将滤膜封于载玻片上，于400 X显微镜下计数穿过PVPF滤膜的细胞数。每膜计数上下左右中5个随机不同视野，每组平行设3个滤膜。运动抑制率淨二 (1_给药组穿膜细鮮均数)xl_ J；对照组穿膜细胞平均数结果显示用终浓度10、20和40 μ mol/L的桑色素_7_硫酸酯钠处理H0-8910PM细胞他后，细胞体外运动能力明显降低，其抑制率分本文档来自技高网...
【技术保护点】
蛋白和ｍＲＮＡ表达，而不抑制ＰＲＬ－３同家族成员ＰＲＬ－１和ＰＲＬ－２蛋白和ｍＲＮＡ的表达，可应用于制备ＰＲＬ－３酶抑制剂的阳性对照试剂或化合物，以及在药物研发中，作为其中一个组分或前体用于制备抗肿瘤转移药物。Ｌ－３酶活性的抑制作用，并采用半数效量概率单位法计算其ＩＣ５０值，然后通过Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室法测定桑色素－７－硫酸酯钠抑制肿瘤细胞的体外转移能力，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和荧光定量ＰＣＲ结果显示桑色素－７－硫酸酯钠能特异性抑制ＰＲＬ－３１．一种桑色素－７－硫酸酯钠抑制ＰＲＬ－３酶活性及在抗肿瘤转移药物中的应用，其特征是通过基因工程技术得到具有酶活性的人ＰＲＬ－３蛋白，通过测定ＰＲＬ－３酶水解底物ＤｉＦＭＵＰ中磷酸基团生成ＤｉＦＭＵ的荧光强度，计算桑色素－７－硫酸酯钠对ＰＲ
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何太平，刘文，梁念慈，
申请(专利权)人：广东医学院，
类型：发明
国别省市：44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。