衣原体诊断方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及用于诊断衣原体感染的新方法，具体而言包括下列步骤：a)收集受试者的标本；b)检测标本中的α-甘露糖苷酶活性；c)α-甘露糖苷酶活性高于诊断实验临界值时，受试者即可诊断为衣原体阳性患者。本发明专利技术诊断方法中的衣原体为沙眼衣原体或肺炎衣原体，受试者标本可以是尿道分泌物、精液、前列腺液、尿液、宫颈分泌物、阴道分泌物、痰液或咽分泌物。本发明专利技术还涉及可用于所述方法的试剂盒，包括选自α-甘露糖苷酶显色底物或α-甘露糖苷酶产荧光底物的检测α-甘露糖苷酶活性的α-甘露糖苷酶酶促底物，这种试剂盒用途是诊断衣原体的有无。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于检测
，涉及通过检测受试者标本α-甘露糖苷酶 (α-mannosidase, α -Manase)活性，诊断受试者感染衣原体(Chlamydia)与否的方法和试剂盒。
技术介绍
衣原体为革兰氏阴性病原体，在自然界中传播很广泛。它没有合成高能化合物 ATP、GTP的能力，必须由宿主细胞提供，因而成为能量寄生物，多呈球状、堆状，有细胞壁，以一般寄生在动物细胞内。从前它们被划归病毒，后来发现自成一类。它是一种比病毒大、 比细菌小的原核微生物，呈球形，直径只有0. 3-0. 5um，它无运动能力，衣原体广泛寄生于人类，哺乳动物及鸟类，仅少数有致病性。已知的与人类疾病有关的衣原体有三种，分别是鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)。其中鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体仅引起肺部感染，而沙眼衣原体则可引起眼部、泌尿生殖道以及肺部感染。鹦鹉热衣原体可通过感染有该种衣原体的禽类，如鹦鹉、孔雀、鸡、鸭、鸽等的组织、血液和粪便，以接触和吸入的方式感染给人类。沙眼衣原体和肺炎衣原体主要在人类之间以呼吸道飞沫、母婴接触和性接触等方式传播。目前检测衣原体技术发展很快，方法日渐增多，有细胞培养法、抗原抗体免疫学检测、生化检测以及核酸检测等方法，但这些方法应用于临床都存在这样或那样的问题。由于鹦鹉热衣原体不常见，临床上常见的是检测沙眼衣原体和肺炎衣原体。1.细胞培养法可选用McCoy细胞、Hela-229细胞和BHK细胞等对衣原体敏感的长成单层的细胞，最常用的是经放线菌酮处理的单层McCoy细胞，载体可用玻璃小瓶或塑料培养板，在底部可预置适当大小的盖玻片。接种标本后，1800-3000g离心lh，促进原体(Elementary body, EB)进入细胞。吸附lh，吸去上清液，加入含放线菌酮0. 5ug/ml的 1640维持液，35°C CO2孵箱或密封培养，48-7 后取出盖玻片，漂洗、甲醇固定后，可作吉姆萨(Giemsa)、碘液或单克隆抗体荧光抗体染色，高倍显微镜或荧光显微镜下观察包涵体 (Inclusion body，IB)。必要时，亦可作盲目传1-3代。资料上一般说细胞培养法的敏感性为80% -90% (但实际采用标本不到50% )， 特异性为100%，是目前诊断衣原体感染最可靠的方法，因此是评价其他实验室诊断方法的金标准。这种方法除了灵敏度存在较大的问题，操作过于复杂也是此法不能用于常规临床检测的重要原因。2.免疫层析法检测衣原体抗原免疫层析法(Immunochromatography)是二十世纪九十年代兴起的一种基于免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)的快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维膜(Nitrocellulose membrane)的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。这种方法用于检测衣原体一般采用双抗体夹心检测衣原体脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)抗原。此法由于操作简单方便，是目前检测衣原体最常运用的技术。但由于脂多糖分子量小，且在细胞壁内，需要一个提取方法，可能使抗原提取不出来或抗原被破坏，致使该方法灵敏度偏低。3.微量免疫荧光法微量免疫荧光(Micro-immunofluorescence，MIF)技术，是检测衣原体抗体较好的方法。检测肺炎衣原体抗体，特异性IgM滴度> 1 16和(或) IgG^ 1 512或双份血清滴度4倍以上升高者，均可诊断急性感染。如IgM<l 16或 IgG^ 1 512，则为既往感染。本方法特异性敏感性均较高，且可用于区分原发感染和再感染，是目前最常用且最敏感的血清学方法。此项技术可作分离物的血清学分型，也可严格应用于血清流行病学的研究。它可给人们提供多方面有用的资料临床致病谱和感染的后果，在不同人群中流行病学的分布。这是一种主观性较强的试验，因此观察者需要有丰富的实践经验。一般认为此法不适用于诊断衣原体的早期感染，且敏感性和特异性均不高。然而此方法作为流行病学调查，颇为简便。4.核酸检测技术这项技术用于检测衣原体主要有连接酶链反应(Ligase chain reaction, LCR)、转录介导的扩增试验(Transcription mediated amplification, TMA)、 聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)、半巢式聚合酶链反应-微空板杂交法(Semi-nested polymerase chain reaction, Semi-nested PCR)、巢式聚合酶链反应 (Nested polymerase chain reaction，nPCR)、实时荧光聚合酶链反应定量检测(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)。此类技术理论上灵敏度和特异性都比较高，但临床实际这两方面都存在较大的问题，而且此类方法操作复杂，技术要求高，不足于应用临床实际。5.生化法检测衣原体这是王则宇等在中国专利生殖道沙眼衣原体快速诊断试剂(ZL01133660. 9)介绍的一种方法。可通过检测衣原体侵入细胞产生包涵体富含糖原 (Glycogen)，致使分泌物中糖含量明显增加，可通过检测糖含量来间接地检测衣原体的存在。此法虽然相比细胞培养、酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immuno-sorbent assay, ELISA)以及核酸检测等操作简单，但由于还需要高温加热和离心等过程，与免疫层析法相比还是过于复杂。该技术的灵敏度虽然比较高，但特异性不足，比如念珠菌存在可造成假阳性，特别在女性月经周期和孕期，阴道上皮糖含量明显增加，也可能会造成假阳性。鉴于沙眼衣原体和肺炎衣原体是人体健康的危害，以及现有检测衣原体方法存在的缺点，研究设计一种适合临床检测需要的衣原体快速检测方法显得尤为迫切！专利技术概述本专利技术人意外地研究发现，可以通过检测受试者标本α-甘露糖苷酶活性，直接诊断受试者标本衣原体的有无。基于这一意外发现，本专利技术涉及一种诊断衣原体感染的新方法，包括下列步骤a)收集受试者的标本；b)检测标本中的α -甘露糖苷酶活性；c) α -甘露糖苷酶活性高于诊断实验临界值时，受试者即可诊断为衣原体阳性患者ο本专利技术诊断方法中的衣原体为沙眼衣原体或肺炎衣原体，受试者标本可以是尿道分泌物、精液、前列腺液、尿液、宫颈分泌物、阴道分泌物、痰液或咽分泌物。本专利技术还涉及一种衣原体诊断的试剂盒，包括选自α-甘露糖苷酶显色底物或甘露糖苷酶产荧光底物的检测α-甘露糖苷酶活性的α-甘露糖苷酶酶促底物，这种试剂盒用途是诊断衣原体的有无。专利技术详述α -甘露糖苷酶是指，按照国际生物化学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the I本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种衣原体诊断方法，包括下列步骤：ａ）收集受试者的标本；ｂ）检测标本中的α－甘露糖苷酶活性；ｃ）α－甘露糖苷酶活性高于诊断实验临界值时，受试者即可诊断为衣原体阳性患者。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王则宇，寇洁，崔晶，王中全，
申请(专利权)人：王则宇，
类型：发明
国别省市：41