用于检测H5亚型禽流感病毒的生物芯片及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供一种用于检测H5亚型禽流感病毒的抗体生物芯片及其制备方法和用途。本发明专利技术所提供的生物芯片包括固相载体、附着于固相载体上的金膜以及与该金膜相连接的抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体，该生物芯片有助于对H5亚型禽流感病毒的快速而准确的检测鉴定，并可以对样品中H5亚型禽流感病毒进行定量分析，真正体现生物芯片特异、灵敏、快速的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物芯片领域，涉及一种用于检测分析H5亚型禽流感病毒的生物芯片及其制备方法和用途。
技术介绍
生物芯片在细菌鉴定、环境监测、病原检测等各个领域展现出广阔的应用前景。生物芯片与传统的仪器检测方法相比，其突出特点是实时、无标记、样品量少、高通量、微型化、自动化、成本低、防污染、检测速度快，在临床诊断和病毒检测方面具有极大的优势。目前，尽管芯片技术已经取得了长足的发展，但是在样品的制备、探针固定、分子标记等方面仍存在着较多问题，而且国外相关的检测仪器和芯片价格昂贵，因此严重制约了国内芯片技术的进一步发展。蛋白质芯片O^roteinchip)是为满足蛋白组学研究需要而发展起来的生物芯片技术，其原理是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，用单克隆抗体固定在载体表面充当捕获探针所构建的蛋白质芯片，称为抗体芯片(Antibody chip，抗体芯片)，其在微生物感染样品检测中具有巨大的潜在应用价值。基于表面等离子体谐振(Surface Plasmon Resonance, SPR)效应的免疫传感器是近年来发展起来的一种新的检测方法。应用该方法可以实时监测生物分子之间的相互作用，而不需要标记和纯化，是当前国内外生物传感分析技术的研究热点之一。其原理如下 当入射光以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将产生全反射，且反射光强度在各个角度上都应当相同。但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光可引起金属中自由电子的共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为谐振角(SPR angle)。谐振角会随着金属薄膜表面接触的液相的折射率的改变而改变，而折射率的变化又与结合在金属表面的生物大分子的质量成正比。检测时，先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。检测器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面分子的结合、解离整个过程的变化。SI^R生物传感器可以通过对反应过程中反射光的吸收获得初始数据，经过相关处理后获得各动力学参数从而对分子间相互作用情况进行分析，判定样品中检测物存在与否。一个多世纪以来，流感一直是威胁着人类健康的重要疾病。伴随着人类流感的流行，禽流感也随之爆发，给世界上很多国家的经济造成沉重的打击，因此WHO和各大研究机构都密切关注着流感的动向。1997年香港、2004年初越南和泰国的H5W感染人事件，突出显示了禽流感的公共卫生意义。现有的禽流感快速诊断方法主要有鸡胚分离法、分子生物学方法(包括一般的RT-PCR、荧光RT-PCR、NASBA等)、胶体金免疫层析技术等。每种诊断方法各有其优点，但又受到几个不利因素的限制，如成本高、处理周期长以及灵敏度低等， 尤其在定量分析禽流感病毒含量及病毒亚型判定的即时、准确性方面尚需改进。
技术实现思路
为有助于理解本专利技术，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本专利技术相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语可用于说明的具体实例的一般类别，但它们的使用不限制本专利技术，权利要求中所概括的除外。除非另外指出，本专利技术所使用的术语“生物芯片”，是指由生物大分子或组织附着于玻璃、陶瓷、金属片或尼龙膜、硝酸纤维素膜等固相载体上构建而成的列阵，生物芯片的实例包括基因(核酸)芯片、细胞芯片、蛋白质芯片、抗体芯片或组织芯片等。除非另外指出，本专利技术所使用的术语“抗H5m亚型禽流感病毒单克隆抗体”，是指抗H5m亚型禽流感病毒主要表面抗原蛋白血凝素的单克隆抗体，按照常规的单克隆抗体制备流程制备。除非另外指出，本专利技术所使用的术语“金膜”，是指由直径在10nm-150nm左右的纳米金粒形成的金膜层。本专利技术利用抗H5m亚型禽流感单克隆抗体制备出用于检测H5亚型禽流感病毒的生物芯片，并建立了 H5亚型禽流感病毒的快速诊断方法，应用SPR生物传感器即时监测本专利技术抗H5W亚型禽流感病毒单克隆抗体芯片表面发生的各种结合、解离反应，具有快速、 简便、敏感、特异、费用较低等特点，可作为现有诊断方法的有益补充，用于分析临床样品或鸡胚、细胞培养物、生物样品中的禽流感病毒并判定其含量。具体地，本专利技术的一个目的在于，提供一种用于检测H5亚型禽流感病毒的检测生物芯片。本专利技术的另一个目的在于，提供制备上述生物芯片的方法及其用途。本专利技术的又一个目的在于，提供基于表面等离子谐振原理，采用上述生物芯片检测H5亚型禽流感病毒的方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案来实现。一方面，本专利技术提供了一种用于检测H5亚型禽流感病毒的生物芯片，其包括固相载体、附着于固相载体上的金膜以及与该金膜相连接的抗H5m亚型禽流感病毒单克隆抗体。优选地，在上述生物芯片中，所述金膜的厚度为50-100nm。优选地，所述生物芯片还包括位于所述金膜上的修饰层，可以选自聚丙烯酰胺、琼脂糖及葡聚糖或其衍生物；优选为羧甲基葡聚糖。优选地，所述生物芯片的固相载体选自玻璃、陶瓷、金属片、尼龙膜和硝酸纤维素膜，优选为玻璃，其规格为18mmX18mmX0. 14mm。另一方面，本专利技术提供制备上述生物芯片的方法，所述方法包括以下步骤1)在生物芯片的固相载体上附着金膜；幻将抗H5m亚型禽流感病毒单克隆抗体固定在步骤1) 所得到的金膜表面。优选地，在上述方法中，所述步骤1)是通过真空蒸发镀膜法在生物芯片的固相载体上附着金膜；优选地，在上述方法中，所述步骤1)中还包括用羧甲基葡聚糖修饰金膜表面的步骤；更优选地，所述步骤幻是通过氨基偶联的方法在经羧甲基葡聚糖修饰的金膜上固定抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体。本专利技术还提供了上述生物芯片在检测H5亚型禽流感病毒及确定其含量中的用途。又一方面，本专利技术还提供了使用上述生物芯片的方法，所述方法包括以下步骤1) 待测样品的处理；幻将上述生物芯片安装在表面等离子体谐振设备(SPR-2002型生物传感器)上；幻将步骤1)中得到的样品加入至步骤幻中的生物芯片上进行反应；优选地，所述反应条件如下反应流速10 μ 1/分钟 100 μ 1/分钟，反应体积为500 1000 μ 1，室温下 (20 30°C )反应20 60分钟；4)利用表面等离子体谐振设备(SPR-2002型生物传感器) 对所述检测生物芯片上反应发生区进行偏振光检测。优选地，在上述方法中，所述步骤1)是通过样品处理缓冲液对待测样品进行处理的，所述样品处理缓冲液成分为 NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4 4. 3mmol/L, KH2PO4 1.4mm0l/L及2% (v/v) Triton Χ_100，ρΗ 7. 2 ；更优选地，所述样品处理缓冲液与样品的体积比为1 1，处理时间优选为室温(20 30°C，优选为25°C )处理90分钟或90分钟以上。此外，本专利技术还可采用以下技术方案来实现。本专利技术提供了一种以抗H5W亚型禽流感病毒单克隆抗体为捕获探针的检测芯片，在所述芯片固相载体上连接抗H5m亚型禽流感病毒单克隆抗体。上述抗H5m亚型禽流感病毒单克隆抗体与附着在芯片固相载体上的金膜连接。 在金膜表面修饰一本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于检测Ｈ５亚型禽流感病毒的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片包括固相载体、附着于固相载体上的金膜、以及与该金膜相连接的抗Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何宏轩，崔大付，王海静，李辉，张璐璐，董国英，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：11