本发明专利技术涉及生物、医学、材料、化学、病毒学等学科的交叉学科领域，具体公开了一种基于量子点和金属配合物的均相免疫荧光检测病毒的方法。其步骤是：首先将量子点溶解于水或其他溶剂中，得反应液A；其次是将病毒的单克隆抗体与金属配合物偶联，将偶联物溶于水或其他溶剂，得反应液B；第三是取反应液A、反应液B及水或其他溶剂混合，得混合溶液C；第四是在混合溶液C中加入病毒溶液，并将其转移至荧光比色皿中，测量其荧光强度，进行定量分析；或将比色皿放置于紫外分析仪中，用数码相机拍照，通过颜色变化进行病毒检测。本方法简便快速、灵敏度高、特异性强、成本低、可实现高通量检测和远程诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物、医学、材料、化学、病毒学等学科的交叉学科领域，更具体涉及。
技术介绍
检测病毒常采用酶联免疫吸附分析法(ELISA)，该法虽然选择性好，但是操作步骤多，费时费力，成本高。采用均相免疫反应进行病毒检测和疾病诊断，具有快速、灵敏、 特异等优点。近年来，由于量子点技术的兴起，不少研究者将量子点技术引入到病毒检测中，但他们用的大多是有机相量子点，由于有机相量子点合成产量有限，大规模使用受到限制。另外，合成有机相量子点需使用有毒的有机溶剂，容易对人体健康产生危害并对环境造成污染。不仅如此，该量子点在进行水溶性化转化中荧光性能还会受到影响。为解决以上问题，申请人合成了一系列掺杂Si的CdTe量子点CdTe :Ζη2+，将此绿色荧光量子点作为荧光敏感材料，用红色荧光的金属配合物标记的抗体作为荧光猝灭剂和荧光强度参照物。由于量子点和金属配合物可用同一激发波长激发，故在同一激发波长激发下，荧光信号表现为绿色和红色的混合色，当加入抗体所对应的抗原(病毒)后，绿色荧光信号不断增强，红色荧光信号保持不变并可作为荧光强度参照，根据绿色荧光信号的强度以及它和红色荧光强度的比值便可实现病毒浓度快速、灵敏、特异的检测。这是一种双色荧光的病毒检测方法，迄今未见有类似报道。文献有关于双色发光氧传感器的报道(Angew. Chem. 2008，120， 7560-7563)，但正如报道中作者所指出的(Angew. Chem. Int. Ed. 2010，49，4907-4909)，该传感器需复杂的设备进行传感和成像，并且在他们的传感器中，所用的荧光参照物是量子点， 由于其对环境因素变化很敏感，故不能保证该传感器的定量精度和准确度。而本申请采用金属配合物作为荧光参照物，稳定性好、易于保存，可在不同环境条件下作为良好的荧光参照物。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的在于提供。采用量子点为荧光信号输出材料，检测灵敏度高；金属配合物作为荧光参照物，稳定性好；金属配合物标记抗体(Ru-Ab)与待测抗原免疫反应进行检测， 特异性强。首先将一定量的量子点与Ru-Ab混合，量子点的荧光被猝灭，而Ru-Ab的荧光强度保持不变；加入1. 8-210ng/ml病毒后，量子点的荧光回升，而Ru-Ab的荧光强度仍然保持不变，这样既可根据量子点的荧光强度变化对病毒含量进行准确定量，还可以根据量子点与Ru-Ab的荧光强度的比值对病毒含量进行半定量检测，同时还可以在紫外分析仪中用紫外灯激发样品溶液进行拍照，得到可视化的图片，通过颜色变化对病毒进行半定量检测。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施，其步骤如下(1)将量子点溶解于溶剂中，得到量子点浓度为1. OX 10~8 1. OX 10-6mol/L的溶液A。所述量子点为CdSe、CdTe, CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、 CdSe :Mn2+、CdTe :Mn2+、CdSe :Zn2+ 或 CdTe :Zn2+。(2)将金属配合物与抗体的偶联物溶解于溶剂中，配制成偶联物浓度为 1. 0Χ1(Γ7 1. 0Xl(T5mol/L 的溶液 B。所述金属配合物为钌(II)配合物、铼(I)配合物或铱(III)配合物。所述步骤(1)和(2)中的溶剂为水或15mMpH8. 0的磷酸盐缓冲溶液(简称“PBS 溶液”)。所述抗体为待测病毒的单克隆抗体。(3)取6μ L溶液A与一定量的溶液B混合，然后用水或0. Olmol · 17 ! . 0的磷酸盐缓冲溶液定容到600 μ L得溶液C，溶液A和溶液B的比例按量子点和金属配合物与抗体的偶联物的摩尔比1 10 1 20计。(4)取溶液C500 1000 μ L于微量荧光比色皿中，以激发波长280 480nm激发， 测量其在发射波长350 700nm处的荧光强度。(5)加入不同浓度的待测病毒于前述的溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度。(6)将量子点的荧光强度回升值对应于病毒浓度作图，可以得到定量检测病毒的工作曲线；或将比色皿放置于紫外分析仪中，用紫外灯激发样品溶液，观察到不同颜色，用数码相机拍照，通过溶液颜色变化对病毒进行半定量检测。本方法用于人体肠道病毒EV71的检测，可在1-15分钟内完成。在进行实际样品检测时，将处理好的待测病毒溶液加入到溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度，以量子点的荧光强度回升值带入工作曲线即可进行定量分析；或用紫外灯激发样品溶液，并用数码相机拍照，通过溶液颜色变化即可实现病毒的半定量检测。本专利技术方法与现有技术相比，具有以下优点和效果与酶联免疫吸附分析及芯片技术相比，本方法灵敏度高、简便快速、选择性好、通用性强。将本方法应用于抗原-抗体反应检测病毒，将使现有的标准检测技术发生根本性变革。如果一种生物分子如抗体或抗原，既可以作为荧光增强剂或猝灭剂，又可以通过与对应的抗原或抗体的特异性相互作用改变体系的荧光特性，便可以建立一种通用的免疫检测技术。基于量子点和金属配合物均相免疫荧光检测病毒的方法将实现生物样品如人体肠道病毒EV71，SARS病毒、禽流感病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、出血热病毒、柯萨奇B3病毒的实时、快速、均相、灵敏及选择性检测。本专利技术的检测方法响应快，亲水性好，灵敏度高，选择性好，通用性强。 附图说明图1为CdTe =Zn2+量子点(QDs)的紫外吸收和荧光发射光谱图；其中曲线a为紫外吸收光谱图，曲线b为荧光发射光谱图。图2为溶液pH变化对QDs (3. 2 X 10_8mol · Γ1)荧光强度的影响；(pH3. 0 9. 0 :15mMPBS 缓冲溶液)。图3中曲线a和b分别为实施例1中的钌(II)配合物的荧光激发光谱荧光发射光谱。图4为本专利技术方法对人体肠道病毒EV71的响应特异性。激发波长460歷，发射波长6IOnm (实施例1)。图5为人体肠道病毒EV71免疫荧光检测过程的示意图；量子点受到金属配合物与抗体的偶联物的影响使荧光猝灭，加入抗原EV71后，由于抗体-抗原间的特异性相互作用，使荧光回升。图6为定量检测人体肠道病毒EV71的荧光图(实施例1)。图7为定量检测人体肠道病毒EV71的工作曲线(实施例1)。具体实施例方式下面结合具体的实施例对本专利技术方法作进一步的描述，以便本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但以下实施例并不以任何形式限制本专利技术。实施例1 ，其步骤为(1)合成 CcTTe =Zn2+ 量子点合成方法参照中国专利申请201110070290. 3，申请日2011年3月23日，具体步骤为配制作为碲源的NaHTe或KHTe溶液将摩尔比为2 5 1的NaBH4或KBH4和Te粉置于水中，0 50°C下搅拌反应5 20h，得到NaHTe或KHTe溶液；在三颈烧瓶中配制Cd2+、 Zn2+和水溶性巯基化合物的混合溶液，其中Cd2+浓度为0. 001 0. 05mol/L,调节溶液的pH 值至7 11后，通氩气10 40min除氧气，注入前面制备好的NaHTe或KHTe溶液，混勻后转入水热反应釜中，加热到160 200°C，反应30 150min，得到量子点溶液；向所得CdTe本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种基于量子点和金属配合物均相免疫检测病毒的方法，其步骤如下：（１）将量子点溶解于溶剂中，得到量子点浓度为１．０×１０－８－１．０×１０－６ｍｏｌ／Ｌ的溶液Ａ；所述的量子点为水溶性量子点；（２）将金属配合物与抗体的偶联物溶解于溶剂中，配升值对应于病毒浓度作图，得到定量检测病毒的工作曲线；或将比色皿放置于紫外分析仪中，用紫外灯激发样品溶液，观察到不同颜色，并用数码相机拍照，通过颜色变化对病毒进行半定量检测。０００ｍＬ于微量荧光比色皿中，以激发波长２８０－４８０ｎｍ激发，测量其在发射波长３５０－７００ｎｍ处的荧光强度；（５）加入不同浓度的待测病毒于前述的溶液Ｃ中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度；（６）将量子点的荧光强度回（３）取６ ｍＬ溶液Ａ与一定量的溶液Ｂ混合，然后用水或０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１ ｐＨ８．０的磷酸盐缓冲溶液定容到６００ｍＬ得溶液Ｃ，溶液Ａ和溶液Ｂ的比例按量子点和金属配合物－抗体偶联物摩尔比１：１０ － １：２０计；（４）取溶液Ｃ ５００－１制成偶联物浓度为１．０×１０－７－１．０×１０－５ｍｏｌ／Ｌ的溶液Ｂ；所述金属配合物为钌（Ⅱ）配合物、铼（Ⅰ）配合物或铱（Ⅲ）配合物；所述步骤（１）和（２）中的溶剂为水或１５ｍＭ ｐＨ８．０的磷酸盐缓冲溶液；所述抗体为待测病毒的单克隆抗体；...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何治柯，陈璐，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。