一种检测恩诺沙星的免疫层析试纸及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测恩诺沙星的免疫层析试纸及其制备方法。本发明专利技术提供的检测恩诺沙星的免疫层析试纸，包括含有超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体的样品垫、连接于所述样品垫一端的硝酸纤维素膜、连接于所述硝酸纤维素膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有恩诺沙星抗原，所述质控线含有能与所述恩诺沙星抗体特异结合的抗抗体。本发明专利技术的实验证明，用本发明专利技术提供的试纸检测恩诺沙星，灵敏度高、特异性强、快速、简便，可实现客观化测定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及恩诺沙星残留物的检测试剂，具体涉及。
技术介绍
恩诺沙星(Enrof loxacin，EF)是一种动物专用的氟喹诺酮类FQs药物，为人工合成的型广谱杀菌性抗菌药物，广泛用于水产及畜禽养殖，已经成为我国目前常用的渔药和兽药之一。近年来关于FQs药物临床应用时所产生的耐药性、残留毒性以及不良反应的报越来越多，食品中相应残留的检测也愈加引起人们的重视。我国是水产品生产、消费和出口大国，恩诺沙星是近几年对水产品主要监控的药残之一。目前现场筛查用检测试剂多用恩诺沙星胶体金试纸进行检测，但因其灵敏度低不能很好满足要求，因此需要开发可在现场更为准确和快速的检测方法。基于抗原-抗体免疫学反应的侧流免疫层析检测技术(LFIAs)是20世纪90年代初发展起来的新兴技术，因其快捷方便的特性，非常适宜用于现场的快速监测。但目前该类技术多采用胶体金作为信号标记分子，受其灵敏度等的限制，只能用于定性检测。超顺磁性复合粒子具有良好的磁学特性，由于其受背景干扰小，特别适宜于不含磁性物质的生物样品的检测。胶体金和荧光标记分子用于测流免疫层析检测时，只可在其检测区膜表面观测到约10%的信号分子强度，而用超顺磁性复合粒子作为标记材料，则可检测到检测区膜三维立体结构中的所有磁信号分子，可极大提高灵敏度，并可用对应的磁信号检测仪达到定量测定，因此，超顺磁性复合粒子是近年来在LFIAs中受到关注的材料。然而，目前报道的生物检测用磁性纳米复合粒子多采用化学法如共沉淀法先制备得到有机相的磁性纳米粒子后，再采用硅(SiO2)或聚苯乙烯、聚丙烯酸、明胶等高分子材料对其表面进行稳定化包覆修饰，以得到稳定的、水溶性的磁性标记材料。但这些制备修饰方法往往较为繁琐复杂，得到的超顺磁性复合粒子在尺寸大小、生物相容性、饱和磁强度、外磁场响应速度、稳定性和标记效率等方面不能同时满足LFIAs的要求其尺寸多在200 300nm之间，由于磁珠颗粒偏大，在试纸上的泳动时间较慢，显色时间较长；而太小的粒子又无法提供足够的磁共振信号；另外还有生物相容性不稳定、磁珠容易聚合等问题；这些不足限制了超顺磁性复合粒子在LFIAs中的应用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测恩诺沙星的免疫层析试纸。本专利技术提供的检测恩诺沙星的免疫层析试纸，包括含有超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体的样品垫、连接于所述样品垫一端的反应垫、连接于所述反应垫另一端的吸水垫；所述反应垫包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有恩诺沙星抗原，所述质控线含有能与所述恩诺沙星抗体特异结合的抗抗体。所述反应垫为硝酸纤维素膜；所述超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体为恩诺沙星抗体和超顺磁性复合粒子的肽键共价结合形成的聚合体；所述恩诺沙星抗体为恩诺沙星单克隆抗体或恩诺沙星多克隆抗体，所述恩诺沙星抗体具体为恩诺沙星单克隆抗体(北京圣迪隆生物科技有限公司，ENX-088)；所述恩诺沙星抗原为恩诺沙星半抗原与载体蛋白的偶联物；小分子抗原物质与载体蛋白偶联时，每个载体蛋白分子上所连接的半抗原的平均数目称为偶联比或结合比。为达到载体蛋白与NC膜的良好结合，同时又能最大程度地保证恩诺沙星半抗原空间位点的延展，选择合适的偶联比是非常重要的。偶联比的大小与半抗原功能基团的活性、位阻、反应投料比及反应条件有关。一般通过调节半抗原与载体的摩尔比、反应环境PH值、温度、离子强度等来控制偶联比。所述载体蛋白与所述恩诺沙星半抗原的偶联比为1 8 1 10，适于抗原的包被和恩诺沙星半抗原空间位点的延展，所述载体蛋白与所述恩诺沙星半抗原的偶联比具体为 1 10 ；所述与所述恩诺沙星抗体特异结合的抗抗体为羊抗鼠IgG抗体；所述恩诺沙星抗原和所述羊抗鼠IgG抗体的浓度均为lmg/ml。所述超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体按照如下方法制备1)将每2.5mg超顺磁性复合粒子、0.96mgl-乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)U. 15mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和Iml浓度为0. 1Μ、ρΗ值为4. 7的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液(称取1. 066g MES,0. 45g NaCl溶于50ml纯水，调pH至4. 7)混勻，反应，得到活化后磁性粒子；2)将每2. 5mg步骤1)得到活化后磁性粒子、0. 15mg恩诺沙星抗体和0. 8ml浓度为50mM pH为8. 5的硼砂缓冲液混勻、反应，得到含有偶联后磁性粒子的反应液；3)向步骤2)得到的反应液中加入BSA混勻得到混合液、反应，得到含有封闭后磁性粒子的反应液；所述BSA在所述混合液中的浓度为5% (质量百分含量)。所述恩诺沙星抗原按照如下方法制备A)取每35. 9ng恩诺沙星、3ml N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)和3ml 二氧六环(二氧六环本身为溶液)混合得到混合液a，B)将每6ml的步骤1)得到的混合液a和沈.2 μ 1三丁基正胺混合，得到混合液 b，向混合液b中加入1. 5μ 1氯甲酸异丁酯反应；得到活化好的恩诺沙星溶液；C)取每IOOmg载体蛋白溶解于IOml浓度0. lmol/L,pH为8. 5的硼酸钠溶液中得到载体蛋白硼酸溶液；D)将每6ml步骤B得到的活化好的恩诺沙星溶液加入IOml步骤C得到的所述载体蛋白硼酸溶液中，反应，得到混合液C。所述超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体的制备方法中步骤1)中，反应温度为37°C，反应时间为0. 5h ；步骤2)中，反应温度为25°C，反应时间为3. 5h ；步骤3)中，反应温度为37°C，反应时间为0.证。所述恩诺沙星抗原的制备方法中步骤A)中，所述混合温度为25°C，所述混合时间为30min，所述混合的方式为震荡；步骤B)中，所述混合的温度为4°C，所述混合的时间为15min，所述反应的温度为 %°c，所述反应的时间为Ih;步骤D)中，所述反应的温度为4°C，反应时间为12h。所述超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体的制备方法中在所述步骤幻后，还包括将所述含有封闭后磁性粒子的反应液中的封闭后磁性粒子进行洗涤、悬浮，得到超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体的步骤，所述洗涤液和悬浮液均为浓度为0. 02mol/L、pH为7. 4的PBS缓冲液。所述恩诺沙星抗原的制备方法中，在所述步骤D)后还包括将步骤D)得到的反应液c透析、冻干，得到恩诺沙星抗原的步骤。所述透析液采用的透析液为浓度为0. 02mol/L、pH为7. 4的PBS缓冲液，透析时间为48h，每乩更换一次透析液。所述恩诺沙星半抗原为恩诺沙星；所述载体蛋白为BSA;由于恩诺沙星是小分子物质，其分子表面特性不利于与反应区即NC膜的直接结合，需要将其与载体蛋白进行偶联后才能借助于载体蛋白的表面特性而达成与NC膜的良好结合。可用作载体蛋白的有各种动物的血清白蛋白，如牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)，还有钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、甲状腺球蛋白、兔血清白蛋白(RSA)、卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)、纤维蛋白原或兔和鸡的丙种球蛋白等。研究发现，BSA理化性质稳定，赖氨酸含量高， 自由氨基多，本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种检测恩诺沙星的免疫层析试纸，包括含有超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体的样品垫、连接于所述样品垫一端的反应垫、连接于所述反应垫另一端的吸水垫；所述反应垫包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有恩诺沙星抗原，所述质控线含有能与所述恩诺沙星抗体特异结合的抗抗体。

【技术特征摘要】
1.一种检测恩诺沙星的免疫层析试纸，包括含有超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体的样品垫、连接于所述样品垫一端的反应垫、连接于所述反应垫另一端的吸水垫；所述反应垫包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有恩诺沙星抗原，所述质控线含有能与所述恩诺沙星抗体特异结合的抗抗体。2.根据权利要求1所述的试纸，其特征在于 所述反应垫为硝酸纤维素膜；所述超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体为恩诺沙星抗体和超顺磁性复合粒子以肽键共价结合形成的聚合体；所述恩诺沙星抗体为恩诺沙星单克隆抗体或恩诺沙星多克隆抗体，所述恩诺沙星抗体具体为恩诺沙星单克隆抗体；所述恩诺沙星抗原为恩诺沙星半抗原与载体蛋白的偶联物； 所述载体蛋白与恩诺沙星半抗原的偶联比为1 8 1 10，具体为1 10; 所述与所述恩诺沙星抗体特异结合的抗抗体为羊抗鼠IgG抗体； 所述恩诺沙星抗原和所述羊抗鼠IgG抗体的浓度均为lmg/ml。3.根据权利要求1或2所述的试纸，其特征在于所述超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体按照如下方法制备1)将每2.5mg超顺磁性复合粒子、0. 96mgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、 1. 15mg N-羟基丁二酰亚胺和Iml浓度为0. 1Μ、ρΗ值为4. 7的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液混勻，反应，得到活化后磁性粒子；2)将每2.5mg步骤1)得到活化后磁性粒子、0. 15mg恩诺沙星抗体和0. 8ml浓度为50mM PH为8. 5的硼砂缓冲液混勻、反应，得到含有偶联后磁性粒子的反应液；3)向步骤幻得到的反应液中加入BSA混勻得到混合液、反应，得到含有封闭后磁性粒子的反应液；所述BSA在所述混合液中的浓度为5% (质量百分含量)。 所述恩诺沙星抗原按照如下方法制备A)取每35.9mg恩诺沙星、3ml N，N- 二甲基甲酰胺和3ml 二氧六环混合得到混合液a，B)将每6ml的步骤1)得到的混合液a和沈.2μ 1三丁基正胺混合，得到混合液b，向混合液b中加入1. 5μ 1氯甲酸异丁酯反应；得到活化好的恩诺沙星溶液；C)取每IOOmg载体蛋白溶解于IOml浓度0.lmol/L,pH为8. 5的硼酸钠溶液中得到载体蛋白硼酸溶液；D)将每6ml步骤B得到的活化好的恩诺沙星溶液加入IOml步骤C得到的所述载体蛋白硼酸溶液中，反应，得到混合液C。4.根据权利要求1-3中任一所述的试纸，其特征在于 所述超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体的制备方法中 步骤1)中，反应温度为37°C，反应时间为0. ;步骤2)中，反应温度为25°C，反应时间为3. ; 步骤3)中，反应温度为37°C，反应时间为0. ！。 所述恩诺沙星抗原的制备方法中步骤A)中，所述混合温度为25°C，所述混合时间为30min，所述混合的方式为震荡；步骤B)中，所述混合的温度为4°C，所述混合的时间为15min，所述反应的温度为25°C， 所述反应的时间为Ih ；步骤D)中，所述反应的温度为4°C，反应时间为12h。5.根据权利要求1-4中任一所述的试纸，其特征在于所述超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体的制备方法中在所述步骤幻后，还包括将所述含有封闭后磁性粒子的反应液中的封闭后磁性粒子...

【专利技术属性】
技术研发人员：马岚，袁航，吴峰，
申请(专利权)人：清华大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：94