本发明专利技术公开了一种表达HAS-vMIP-Ⅱ融合蛋白的表达体系，由质粒pPICZaA-HSA-vMIP-Ⅱ转化至巴斯德毕赤酵母得到。本发明专利技术还公开了该表达体系的构建方法，是从含有质粒pPICZaA-HSA-vMIP-Ⅱ的大肠杆菌中提取重组质粒，对重组质粒进行线性化，电转化法转化巴斯德毕赤酵母菌感受态细胞，经抗性筛选后，PCR鉴定得到阳性克隆，利用阳性克隆子进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE分析，Western-Blot鉴定。本发明专利技术使得vMIP-Ⅱ在不丧失功能的情况下，在血浆中的半衰期得到显著地延长。这样HSA-vMIP-Ⅱ融合蛋白会降低给药频率和剂量，发挥出与vMIP-Ⅱ相似的药效作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种能够高效表达HSA-vMIP- II融合蛋白的酵母表达体系及其构建方法。
技术介绍
卡波氏肉瘤(Kaposi’ s sarcoma，KS)是一种血管多发性肿瘤，常见于免疫缺陷病的患者。自从AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome)流行以来，KS己成为非洲地区最常见的肿瘤之一。对KS或可能患有KS的高危人群进行活检，发现了卡波氏肉瘤病 # (Kaposi's sarcoma-associate herpsvirus, KSHV) WSSiIDNA,毒8 (HHV8)，表明KSHV参与了 KS的病理发生过程。卡波氏肉瘤病毒是HIV感染者或移植病人用免疫抑制剂后常发生的Kaposi肉瘤的病原体。此病毒共有80余个基因，其K6和K4基因分别编码一个类似于人单核细胞炎性蛋白-Ia (MIP-Ia)的蛋白产物病毒巨噬细胞炎症蛋白I (viral macrophage inflammatory protein-I，vMIP-I)和病毒巨噬细胞炎症蛋白 II (vMIP- II),vMIp- I 由 289 bp的开放阅读框(ORF) K6基因编码，蛋白分子大小为10. 5 KDa,与hMIP_l β的氨基酸序列同源性为37. 9%, vMIP- II是由ORF K4基因编码的10. 5KDa蛋白，与hMIP-la的氨基酸序列同源性为41. 1%，vMIP-I和vMIP- II的同源性为48%，两者的基因序列有70%的一致性， 而另一种vMIP- III与两者基因相比只有37%的同源性。vMIP- II全基因编码94个氨基酸，成熟蛋白为74氨基酸，与人的MIP同源性高达 41%，其中8种非极性氨基酸占40%，具有较强的疏水性。vMIP- II蛋白与人类的CC类趋化因子在氨基酸序列上有较高的同源性。vMIP- II蛋白的二级结构和折叠方式与趋化因子有相同之处，但也存在差异，即使在较高的浓度水平上也呈单体结构，正是这种单体结构使它能够采取任何一种二聚体形式与细胞表面的受体结合，从而解释了它与趋化因子受体之间有交叉连接关系。vMIP- II N末端的受体结合部位高度无序，在保守的半胱氨酸区有带正电荷的氨基酸残基，而CC类趋化因子通常有疏水性或中性氨基酸残基，这一区域对CC类趋化因子二聚体形成起着重要作用，从而说明vMIP- II缺乏二聚体结构的原因。vMIP- II与趋化因子受体结合区域主要是非典型区域，这一区域主要包括两个部位参与受体的结合及活化一个是蛋白N末端的近8 10氨基酸残基，另一个是N — loop环。vMIP- II三维结构是通过2个二硫键和由β片层、C端超螺旋结构形成的疏水核团来维持。vMIP- II蛋白可以广谱地结合CC和CXC两类趋化因子家族受体，如CCRl、CCR2、CCR3、CCR5、CCR8、CCR10、 CXCR4、CX3CR等10余种趋化因子受体。用来源于vMIP- II N末端的Vl肽段对vMIP- II结构和功能进行研究，结果表明，Val-I、Arg-7、Lys-9残基对vMIP- II结合CXCR4受体起重要作用。因此vMIP- II蛋白不仅能够通过与趋化因子受体结合在免疫炎症病理反应中发挥作用，而且还可以作用于免疫细胞上的趋化因子受体，通过激动或拮抗受体来调节免疫细胞的功能，在HIV感染/艾滋病和移植排斥反应等方面有更多的研究应用价值。vMIP- II能与作为HIV感染的辅助受体的趋化因子受体结合，干扰HIV的gpl20与辅助受体的结合而可以抑制HIV的感染。试验证实，对于HIV-I病毒89. 6株(可以广泛的利用辅助受体CCR3、 CCR5、CXCR4进行感染)，vMIP- II可以具有与RANTES和SDF-Ia相同或者稍差的阻断其利用 CCR5和CXCR4受体的作用。进一步研究证实，vMIP- II结合CCR5的结合部位和分子机制不同于RANTES (CCL5)和MIP-I α，并具有更高的结合常数。利用NMR研究认为，νΜΙΡ- II是在单体状态下发挥作用的。已有报道，克隆表达的νΜΙΡ- II具有野生型νΜΙΡ- II的活性。CCR8也是HIV感染的辅助受体之一，尤其在脑组织和淋巴组织的感染过程中， νΜΙΡ- II也可以通过结合CCR8而抑制HIV感染这些组织的细胞。HIV感染机制中辅助受体扮演的角色，为抗HIV治疗提供了新靶点。在能够介导体外HIV-I进入细胞的众多趋化因子受体中，CCR5和CXCR4有药理学意义。以CCR5、CXCR4为靶向的抗病毒治疗在疾病各阶段都有作用，R5株是最常传播的毒株，主要出现于疾病无症状期，因此针对CCR5的抗病毒治疗宜在早期进行，而X4株主要在疾病发展晚期，象征疾病进展，所以针对CXCR4的治疗主要在疾病晚期有效。目前采用的能够阻断CCR5和CXCR4的主要方案有以下三种一是对那些CD8 + T细胞不能产生足够趋化因子者人为地给予更多的趋化因子；二是开发能直接阻断辅受体结合位点的药物；三是将缺失性CCR5基因用于干细胞移植。生物技术的发展极大地促进了多肽/蛋白药物的研发，截止2004年2月，美国FDA 批准了 64种重组多肽/蛋白类治疗药物上市。药代动力学研究表明多肽/蛋白类药物主要通过降解、排泄、以及受体介导的内吞等作用在体内被清除。其中分子量小于20KDa的多肽因子在代谢过程中易被肾小球滤过，通过肾小管时多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并从尿中排出，因而半衰期短。以β干扰素为例，肌肉注射的体内半衰期一般在2h-4h左右，即使大剂量给药六个半衰期(24h)后，其血药浓度已无法达到抑制病毒复制的目的。为了达到的治疗效果，需要频繁的大剂量用药，长期的频繁注射不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且易引发一系列严重的毒副作用。长效多肽/蛋白类药物的开发已成为对第一代基因工程多肽/蛋白药物进行二次开发的重要方向。目前延长蛋白药物半衰期的主要基于增大蛋白药物的分子量，减少肾小球滤过率，减少异源蛋白的免疫原性，从而减少其体内清除率，持续缓慢释放维持药物浓度，延长药物作用时间等三个方面考虑。常用技术有制备缓释制剂、构建突变体、化学修饰以及基因融合等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够高效表达HSA-vMIP- II融合蛋白的酵母表达体系。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的一种表达HSA-vMIP- II融合蛋白的表达体系，由质粒pPICZaA-HSA-vMIP- II转化至巴斯德毕赤酵母(pichia pastorid)得到。所述质粒pPICZaA-HSA-vMIP- II来源于含有质粒pPICZaA-HSA-vMIP- II的大肠杆菌 DH5a。所述巴斯德毕赤酵母菌株优选为酵母菌X33。上述表达体系的构建方法，是从含有质粒pPICZaA-HSA-vMIP- II的大肠杆菌中提取重组质粒，对重组质粒进行线性化，利用电转化方法转化巴斯德毕赤酵母菌感受态细胞，经抗性筛选后，PCR鉴定得到阳性克隆，利用阳性克隆子进行诱导表达，对表达产物进行 SDS-PAGE分析，Western-Blot鉴定，获得表达体系。上述质粒的构建方法为上述质粒pPIC ZaA-HSA-v本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种表达ＨＳＡ－－ｖＭＩＰ－Ⅱ融合蛋白的表达体系，由质粒ｐＰＩＣＺａＡ－ＨＳＡ－ｖＭＩＰ－Ⅱ转化至巴斯德毕赤酵母得到。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙晗笑，贾忠伟，肖威，莫雪梅，李秀英，张光，王峰，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81
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