哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法、应用以及表达该抗原的菌株技术

本发明专利技术涉及哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法、应用以及表达该抗原的菌株。本发明专利技术以哈维氏弧菌致病菌株zj2008株为模板，用PCR法克隆抗原ompK的编码基因，将该基因构建到真核表达载体pPIC9K中获得重组载体pPIC9K-ompK；重组载体线性化后转化毕赤酵母细胞GS115，经抗性筛选和PCR鉴定获得整合了重组载体的阳性酵母克隆；重组的酵母经甲醇诱导分泌表达ompK，分子量约为36kDa，产量达2mg/L。重组酵母经甲醇诱导表达3天后离心，收集上清，浓缩后获得粗纯化的蛋白溶液，以浓缩后的蛋白抗原制口服疫苗，免疫实验鱼，一段时间后对攻击感染产生有效的免疫保护性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法和该抗原作为抗海水鱼类弧菌病疫苗的应用，以及表达该抗原的菌株。
技术介绍
弧菌为革兰氏阴性杆菌或弯曲杆菌，广泛分布于海洋、河口等各种盐度的水生环境，也可见于人或鱼肠道中。弧菌是最主要的海水养殖动物的病原菌，由病原弧菌引起的感染性疾病在世界各地普遍流行。我国沿海各省海水养殖业发达，但主要养殖品种如大黄鱼、鲈鱼、石斑鱼、牙鲆、大菱鲆、欧洲鳗等均受到弧菌病的严重危害。传统的抗生素治疗在防治海水动物弧菌病中曾经发挥了重要的作用，但是由于长期用药可能引起水产品药物残留和耐药菌的传播问题，目前农业部对抗生素在水产养殖中的使用已有严格的规定，能够应用的种类少之又少。近年来，免疫预防由于其对动物无副作用、对环境的友好特性、预防特定疾病的有效性而备受重视，疫苗在水产动物病害控制中的应用正逐步推广。目前在养殖实践中应用的多数为灭活疫苗，一般以浸泡的方式进行免疫接种，存在相对保护率较低、有效保护期不长等不足。研究者们努力开展基因工程疫苗研究，应用大肠杆菌表达的亚单位疫苗成分进行注射或口服免疫，但是，由于原核表达的重组蛋白多数本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种毕赤酵母重组菌株（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５－ｏｍｐＫ，它的保藏编号为ＣＧＭＣＣＮｏ．４３６２，其具有分泌表达如序列（４００）２的氨基酸序列的可溶性哈维氏弧菌外膜蛋白ｏｍｐＫ抗原的能力。

【技术特征摘要】
1.一种毕赤酵母重组菌株(Pichiapastoris)GSl 15-ompK，它的保藏编号为 CGMCCNo. 4362，其具有分泌表达如序列<400>2的氨基酸序列的可溶性哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的能力。2.一种哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的DNA，它的核苷酸序列如序列<400>1所述。3.—种哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原，它的氨基酸序列如序列<400>2所述。4.一种如权利要求3所述的哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法，是以哈维氏弧菌鲈鱼分离致病株(Vibrio harveyi)zj2008的基因组DNA为模板，用PCR方法克隆ompK的编码基因，将该基因重组到表达质粒pPIC9K中，获得重组质粒pPIC9K-ompK，将重组质粒线性化，以原生质体转化的方法整合到毕赤酵母GSl 15细胞中，获得整合了质粒pPIC9K-ompK DNA的毕赤酵母重组菌株，该毕赤酵母重组菌株GSl 15-ompK的保藏编号为CGMCC No. 4362， 转化的毕赤酵母GS115重组菌株细胞在甲醇诱导下表达重组蛋白，重组蛋白以可溶性的形式分泌到培养液中，表达的蛋白经离心后收集，浓缩；所述哈维氏弧菌鲈鱼分离致病株 zj2008 的保藏编号为 CG...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛芝娟，何超军，陈吉刚，吴雄飞，
申请(专利权)人：毛芝娟，
类型：发明
国别省市：97