绿脓杆菌的外膜蛋白PA5158制造技术

本发明专利技术的目的旨在提供用于诊断、预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的蛋白质抗原或肽抗原和抗所述抗原的抗体。根据本发明专利技术，提供了衍生自绿脓杆菌外膜蛋白ＰＡ５１５８的蛋白质或肽和针对它们的抗体，用于诊断、预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及衍生自绿脓杆菌外膜蛋白PA5158的蛋白质抗原或肽抗原 和针对该抗原的抗体。本专利技术也涉及包含该抗原的疫苗组合物。本专利技术还 涉及包含所述抗体的药物组合物、用于绿脓杆菌感染的诊断剂、用于检测 绿脓杆菌的试剂盒和增强氨基糖苷类抗生素的抗绿脓杆菌活性的增效剂。
技术介绍
绿脓杆菌(铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))是广泛分布于自 然环境例如土壤和水中的革兰氏阴性杆菌，引起抵抗治疗的严重致命感染。 绿脓杆菌的主要感染对象是宿主防御功能减弱的缺乏抵抗力的患者，通常 称作易感染性宿主，包括烧伤、器官移植和癌症患者。绿脓杆菌是院内感 染的主要病原菌。此外，由这种细菌引起的肺部感染对嚢性纤维化患者是 致命的。对这些患者主要施用具有抗绿脓杆菌活性的抗菌剂，而众多病例 则因绿脓杆菌耐药性而未能获得充分的治疗效果。另外，也已经长时间地 研究针对绿脓杆菌的疫苗或抗体。然而，直接使用该细菌灭活形式的方法 具有缺点，即必须根据绿脓杆菌的不同血清型制备不同类型的疫苗或抗体。在这种情况下，期待利用具有绿脓杆菌菌林间共同氨基酸序列的绿脓 杆菌蛋白被动免疫或主动免疫来预防或治疗绿脓杆菌感染。例如，已知其 中外膜蛋白OprF和Oprl的部分相互融合的重组蛋白(日本特开第 245699/1996号公才艮)和IV型菌毛蛋白(WO2004/099250)作为此种绿脓杆菌 蛋白应用于疫苗的情形。另外，已经才艮道抗IV型菌毛抗体(W02004/099250)、抗PA1706(或 PcrV)抗体(美国专利号6309561和6827935)等作为靶向绿脓杆菌蛋白的抗体药物。然而，在显示多样血清型的绿脓杆菌临床分离林间共同拥有的细菌蛋 白可以作为"共同抗原，，应用于预防、诊断或治疗绿脓杆菌感染，并且因此 一直是需要的。已经报道由PAS158(或opmG)基因编码的PA5158(也称作OpmG)蛋 白是构成直接参与氨基糖苷类抗生素耐药性的流出泵的外膜蛋白 (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2003， 47， 1101-1111)。然而，该蛋白质用作疫苗成分和针对该蛋白质的抗体用作绿脓杆菌感染的治疗剂或 诊断剂是完全未知的。专利技术简述本专利技术人已经尝试从绿脓杆菌外膜蛋白中鉴定新和有用的"共同抗 原"。在多次研究后，本专利技术人已经通过基因芯片分析发现编码存在于绿脓 杆菌外膜中的PA5158(也称作OpmG)蛋白的基因稳定地表达，无论人血清 存在或不存在(实施例1)。另外，本专利技术人已经通过对88林绿脓杆菌临床 分离株的基因分析发现PA5158蛋白的2个推定胞外区不存在可检测的氨 基酸突变并且完全是保守的(实施例2)。此外，本专利技术人已经证实用PA5158 重组蛋白免疫获得的抗血清或抗体在绿脓杆菌感染的才莫型小鼠上显示强效 的抗感染保护作用(实施例9-12)，该抗体与PA5158蛋白结合(实施例7、 8 和13)并且该抗体显示增强氨基糖苷类抗生素的抗绿脓杆菌活性的作用(实 施例14)。本专利技术基于这些发现。本专利技术的目的是提供用作疫苗组合物的蛋白质抗原或肽抗原，其中所 述疫苗组合物具有实质的预防或治疗绿脓杆菌感染的能力并且可以对源自 绿脓杆菌感染患者的多种临床分离林反应，或是提供针对所述抗原的抗体。根据本专利技术，提供了包含可诱导产生抗绿脓杆菌PA5158蛋白抗体的 蛋白质抗原或肽抗原的抗原组合物。根据本专利技术，提供了选自下列的蛋白质(本文中此后称作"本专利技术的蛋 白质")(i) 包含序列编号4的氨基酸序列的蛋白质；(ii) 蛋白质，包含序列编号4中缺失、替换、插入或添加一个或多个氨 基酸的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能 等同；(iii) 蛋白质，由在严格条件下与编码序列编号4的氨基*列的多核普 酸杂交的多核苷酸编码，并且与由序列编号4的氨基^列组成的蛋白质 功能等同；和(iv) 蛋白质，包含与序列编号4的氨基酸序列具有70%或更大同一性 的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同.根据本专利技术，提供了包含序列编号5的氨基酸序列或含有一个至数个 保守性替换的序列编号5的氨基酸序列的肽(本文中此后称作"本专利技术第一 实施方案的肽")。根据本专利技术，提供了包含序列编号6的氨基酸序列或含有一个至数个 保守性替换的序列编号6的氨基酸序列的肽(本文中此后称作"本专利技术第二 实施方案的肽，，)(本文中此后有时将本专利技术第一实施方案的肽和本专利技术第 二实施方案的肽统称为"本专利技术的肽")。根据本专利技术，提供了包含本专利技术的蛋白质或本专利技术肽的抗原组合物(本 文中此后将这种抗原组合物和包含可诱导产生抗绿脓杆菌PA5158蛋白抗 体的蛋白质抗原或肽抗原的抗原组合物统称为"本专利技术的抗原组合物")。根据本专利技术，提供了用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的疫苗组 合物，包含本专利技术的抗原组合物和任选地一种或多种可药用的载体、稀释 剂和/或佐剂。根据本专利技术，提供了针对绿脓杆菌PA5158蛋白或其部分的抗体，或其功能性片段(本文中此后称作"本专利技术的抗体")。根据本专利技术，提供了在保藏号FERM BP-10672下保藏的杂交瘤。 根据本专利技术，提供了用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的药物组合物，包含本专利技术第一实施方案的抗体和任选地一种或多种可药用的载体和/或稀释剂。根据本专利技术，提供了用于绿脓杆菌感染的诊断剂，包含本专利技术第一至 第三实施方案的任一抗体。根据本专利技术，提供了用于检测绿脓杆菌的试剂盒，包含本专利技术第一至 第三实施方案的任一抗体。根据本专利技术，提供了增强氨基糖苷类抗生素的抗绿脓杆菌活性的增效 剂，包含本专利技术第一至第三实施方案的任一抗体。本专利技术提供具有实质的预防或治疗绿脓杆菌感染的能力并且还对源自 绿脓杆菌感染患者的多种临床分离林反应的疫苗组合物和多克隆抗体或单 克隆抗体。它们可以应用于绿脓杆菌感染的预防剂或治疗剂或用于绿脓杆 菌感染的诊断剂。此外，本专利技术的抗体与在绿脓杆菌外膜中或在绿脓杆菌胞外存在的PA5158蛋白的胞外区结合。此外，据估计这些区域是在菌林间极端高度保 守的，与血清型等无关，并且与多种临床分离林反应。因此，本专利技术的抗 体预期对绿脓杆菌感染具有高的治疗效果。附图简述图l显示pET15b质粒(pET-PA5158國l)。专利技术详述PA5158蛋白PA5158蛋白是衍生自绿脓杆菌的外膜PA5158蛋白。该蛋白质的氨基 酸序列和编码该蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列分别在序列编号3和序列 编号1中描述。在本上下文中，基于信号序列和有关与PA5158蛋白高度同源的绿脓 杆菌PA0427(OprM)蛋白(J. Biol. Chem.， 2004， 279， 52816-52819)的立体结 构信息、有关大肠杆菌(E.coli)TolC蛋白(Nature， 2000， 405， 914-919)的立体 结构信息和有关PA5158蛋白的二级结构信息，估计在作为核苷酸序列序 列编号1的氨基酸编码区的1479个核苷酸中第337位至1479位核苷酸的核苷酸序列编码PA5158蛋白的细胞表面暴露部分(序列编号2)。 PA5158蛋白的细胞表面暴露部分是选自下列的蛋白质(i) 包含序列编号4的氨基酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗原组合物，其包含能够诱导产生抗绿脓杆菌ＰＡ５１５８蛋白抗体的蛋白质抗原或肽抗原。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：田中二朗，大泽福市，奥富隆文，长曾宏，熊谷正志，铃木贵久，大冢圭子，
申请(专利权)人：明治制果株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]