本发明专利技术公开了一种莲膜联蛋白及其表达载体和应用，属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术的莲膜联蛋白具有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列，其编码基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明专利技术还公开了该莲膜联蛋白的表达载体，是由其编码基因插入到原核或真核表达载体中构建而成的。本发明专利技术的莲膜联蛋白能够有效提高植物种子耐热性能，增强种子的萌发活性，在植物品种选育和农业生产领域具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学与植物基因工程
，具体涉及一种提高植物种子耐热性和种子活力的莲膜联蛋白及其应用。
技术介绍
高温是影响植物生长、发育和繁殖的重要环境因素之一。由于温室效应的影响，全球暖化的趋势日益明显，高温导致的种子活力和存活率下降对作物品质和产量造成的危害也日益加剧，因此，研究种子耐热机制，寻找提高种子耐热性和活力的关键基因，具有重要的科学意义和经济价值。m、Ne lumbo nuc if era Gaertn.)种子是迄今为止被证实的最长寿和最耐高温的禾中子之一 (；Shen-Miller, et al. , 1995, Exceptional seed longevity and robust growth: ancient sacred lotus from China. Am J Bot 82: 1367-1380;)，表明莲种子具有非常高效的防御和修复系统，为我们挖掘种子耐热性和种子活力相关的新基因提供了极佳的材料。膜联蛋白(Armexins)是一类Ca2+及磷脂结合蛋白，在除酵母以外的生物界普遍存在(Mortimer, et al. , 2008，Annexins multifunctional components of growth and adaptation. J Exp Bot 59: 533-544)。植物膜联蛋白参与胞外分泌，细胞伸长，细胞壁合成，根瘤形成和果实成熟等生理过程。越来越多的研究表明植物膜联蛋白具有过氧化物酶的活性，参与植物中各种逆境应答反应，包括低温胁迫，干旱胁迫， 盐胁迫，重金属胁迫和氧化胁迫等(Breton，G.，et al.，2000，Two novel intrinsic annexins accumulate in wheat membranes in response to low temperature. Plant Cell Physiol 41: 177-184;Lee，S.，et al.，2004，Proteomic identification of annexins, calcium-dependent membrane binding proteins that mediate osmotic stress and abscisic acid signal transduction in Arabidopsis. Plant Cell 16: 1378-1391；Jamij S. K.，et al.， 2008，Ectopic expression of an annexin from Brassica juncea confers tolerance to abiotic and biotic stress treatments in transgenic tobacco. Plant Physiol Bioch 46: 1019-1030； Konopka-Postupolska， D.，et al.，2009，The role of annexin 1 in drought stress in Arabidopsis. Plant Physiol 150: 1394-1410)。由于活性氧(ROS)的大量产生导致的氧化胁迫被认为是热伤(Kim, K. H. , et al. , 2010， Enhanced tolerance of transgenic tall fescue plants overexpressing 2~Cys peroxiredoxin against methyl viologen and heat stresses. Biotechnol Lett 32: 571-576)，膜联蛋白在热适应中的作用不容忽视。Rhee 等(Rheej H. J.，et al.，2000，Annexin Iisa stress protein induced by heat, oxidative stress and a sulfhydryl-reactive agent. Eur J Biochem 267: 3220-3225)对动物细胞进行热处理时发现高温提高了 annexin I的表达，表明其可能是热胁迫响应蛋白，但目前在植物中尚无膜联蛋白与种子耐热性相关的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术中的上述不足，提供一种与植物种子耐热性和活力相关的蛋白莲膜联蛋白。本专利技术的另一目的是提供上述莲膜联蛋白的表达载体。本专利技术的又一目的是提供上述莲膜联蛋白的应用。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的一种莲膜联蛋白，命名为NnANNl {Nelumbo nucifera Annexinl)，来源于中国莲 Qielumbo nucifera Gaertn.)，是如下(1)或(2)的蛋白质(1)该蛋白的氨基酸序列如SEQID N0:1所示；(2)通过将序列SEQID NO: 1经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白质，且该蛋白与(1)的蛋白具有相同的生物活性。上述莲膜联蛋白的编码基因(MANN1基因)，NnANNl开放读码框为948 bp, 5' -UTR为63 bp, 3' -UTR为312 bp，编码315个氨基酸。该编码基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 2所示。或者与SEQ ID NO: 2所示序列有90%以上同源性，且该DNA分子编码的蛋白与(1)的蛋白具有相同生物活性。一种莲膜联蛋白表达载体，包含莲膜联蛋白的编码基因。即将编码基因插入到出发载体中得到，出发载体可以选用本领域已知的的各种载体。上述出发载体优选为原核表达载体pET14b、pET3h或真核表达载体PBI121等。一种莲膜联蛋白表达载体的制备方法，步骤如下(1)以莲CDNA文库为模板，以SEQID NO:3、为引物进行PCR，得到莲膜联蛋白的编码基因；(2)将步骤(1)的PCR产物与pGEMT-Easy载体进行连接，得到中间载体；(3)中间载体转化大肠杆菌DH5α感受态，培养后进行PCR、酶切和测序鉴定；(4 )鉴定正确的菌体进行双酶切后与出发载体连接，连接产物再次转化大肠杆菌DH5 α 感受态，培养后进行PCR、酶切和测序鉴定，鉴定正确的即为莲膜联蛋白表达载体。一种根癌农杆菌，含有上述的表达载体，优选的出发菌株为根癌农杆菌EHA105。上述莲膜联蛋白或其编码基因在提高种子耐热性能或/和促进种子萌发活性中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果通过植物表达载体将本专利技术的莲膜联蛋白转入植物中，可以提高植物种子在热胁迫和人工老化条件下的萌发活力。将转入表达质粒的种子和野生型种子用50°C高温处理他后进行萌发实验，结果显示处理过的种子萌发速度和最终萌发率都明显高于对照的野生型种子，表明能提高植物种子在热胁迫下的萌发活力。人工老化处理后萌发实验结果显示处理过的种子的萌发速度和最终萌发率都远高于野生型种子，表明野生型种子大部分都丧失了活力，而处理的种子仍然保持较高的活力。上述结果表明NnANNl具有提高植物种子耐热性和活力的能力。该蛋白对于种子耐热分子机制的研究，高活力和耐热性的品种的选育具有重要的理论意义和经济本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种莲膜联蛋白，其特征在于该蛋白的氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄上志，楚璞，陈虎辉，黎茵，周玉亮，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81
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