本发明专利技术涉及一种磷脂酶C及含其的食品用酶剂、以及食品原料的处理法，提供一种磷脂酶C，该磷脂酶C具有于酸性pH区域或中性pH区域附近有效水解各种磷脂的能力，在柠檬酸缓冲液中也具有活性，并且具有一定程度的热稳定性，还具有不会水解不含脂质部分的磷酸酯的性质。此磷脂酶C于酸性至中性的pH区域中表现出活性，且实质上不水解除磷脂以外的磷酸酯。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种磷脂酶C、可制造该磷脂酶C的丝状菌、自丝状菌培养物中分离出该磷脂酶C的方法、编码该磷脂酶C的DNA，以及该磷脂酶C的制造方法等。具体而言，本专利技术涉及一种特别适用于食品工业及医药品工业的磷脂酶C，特别是由丝状菌中的米曲霉 (Aspergillus oryzae)或溜曲霉(Aspergillus tamarii)所制造的磷脂酶C、生产该磷脂酶C的丝状菌、自丝状菌培养物中分离精制出该磷脂酶C的方法、编码该磷脂酶C的DNA，以及该磷脂酶C的制造方法等。
技术介绍
[1]磷脂酶 C先前已知有动物及微生物可制造磷脂酶C。源自动物的酶主要是具有磷脂酰肌醇 (phosphatidyl inositol)选择性的磷脂酶C，而源自微生物中的细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的磷脂酶C也是已知的。细菌、放线菌及酵母菌所制造的磷脂酶C，几乎都对磷脂酰肌醇或磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)具有选择性。已知源自细菌的磷脂酶C例如由下列细菌所制造fsudomonus schuylkilliensis (例如见于专利文献1 日本特开昭50-1017183号)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Bulkholderia pseudomallei，例如见于非专利文献 1 =Korbsrisate S 等·，Jounal of Clinical Microbiology, 1999, Vol. 37，3742-3745)、赌样芽胞杆菌(Bacillus cereus，例如见于非专利文献 2 =Tan C.等，Protein Expression and Purification, 1997, Vol. 10， 365-372)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，例如见于非专利文献3 =Daugherty S.等，Infection and Immunity，1993，Vol. 61，5078-5089)，以及产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens，例如见于非专利文献 4 :Titball R.等，Infection and Immunity, 1989, Vol. 57, 367-376)等等。已知源自放线菌的磷脂酶C例如是八丈岛链霉菌(Sti^ptomyces hachijyoensis)(例如见于专利文献2 日本特开昭49-55893号)所制造的磷脂酶C。源自酵母菌的磷脂酶C已知例如是下列酵母菌所制造的白色念珠菌(Candida albicans，例如见于非专利文献 5 =Andaluz E.等，Yeast, 2001, Vol. 18，711-721)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae,例如见于非专利文献 6 :Payne W.等，Molecular and Cellular Biology, 1993，Vol. 13,4351-4364)。已知源自霉菌的磷脂酶C有两例。其一来自黑曲霉菌(Aspergillus niger，例如见于专利文献3 日本特开第2000-166543号)，另一来自佐氏曲霉菌(Aspergillus saitoi)(例如见于非专利文献 7 =Matsuoka S.等，Biotechnology and AppliedBiochemistry,1987，Vol. 9，401-409)。[2]卵磷脂卵磷脂是广泛分布于动物、植物、菌类中的代表性甘油磷脂。所谓的甘油磷脂是指磷酰碱以共价键与1，2_ 二酰基甘油的3-位结合的化合物，其中碱的部分包括胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇以及甘油等，其组成比 例依来源而有所不同。卵磷脂在使用上是归属于甘油磷脂类。卵磷脂具有表面活性功能、抗氧化功能及生理活性功能等，可应用于食品、饲料、 医药品等中。在食品工业中，以蛋黄卵磷脂及大豆卵磷脂等为代表的天然卵磷脂可作为食品添加物使用，其主要是作为乳化剂等以改变食品性质，所以供给量甚多。[3]卵磷脂的酶处理现也正在进行使用酶将卵磷脂部分水解，以赋予其新性质的研究。现今所用的酶为磷脂酶类的酶，已知有磷脂酶A、B、C、D等，其中磷脂酶A可选择性水解甘油磷脂的1-或 2-位的脂肪酸，磷脂酶B可进行非选择性水解，磷脂酶C可水解出二酰基甘油及磷酰碱，磷脂酶D可分解出磷脂酸及碱。于食品工业领域中，现在最常使用的是磷脂酶A。虽然卵磷脂难溶于水，但若使用磷脂酶A处理卵磷脂，则其酰基可部分水解而生成水溶性的溶血卵磷脂(lysolecithin)。 将溶血卵磷脂用作食品添加物时，所得食品的物性与习知使用卵磷脂所得食品的物性可能不同。[4]神经鞘氨醇磷脂(sphingophospholipid)神经鞘氨醇磷脂是由甘油磷脂与磷脂所构成的，代表为神经鞘磷脂 (sphingomyelin)，其是胆碱磷酸与神经酰胺(ceramide)的伯醇经磷酸二酯结合的化合物，广泛存在于动物脏器中。母乳中也含有，因此有时也将其添加入婴儿用奶粉中。若使用磷脂酶C处理神经鞘磷脂，则可使胆碱磷酸脱落而生成神经酰胺。神经酰胺现正广泛应用于化妆品中作为保湿成分，又有报导称异位性皮肤炎是由于神经酰胺不足所造成的。[5]磷脂酶C在食品中的应用于水存在下使用磷脂酶C，即可自卵磷脂制造二酰基甘油，如下图所示H^^ O CO^i “ R^HgG Q ...........^Q......................^HC-O~~^-CD-B^ + I^O --HC-0~^CH-Rsi + R3----PQ4IH2CO“P——RaH2C-OHOs卵磷脂二酰基甘油上式中R1及R2各自表示烷基，R3表示胆碱、乙醇胺、甘油、肌醇等基团。于食品原料中引起如上反应，即可提供一种附加有与磷脂酶A本质上不同的特性的商品。此处所使用的磷脂酶C必须能够水解各种甘油磷脂。例如，大豆卵磷脂中是以磷脂酰胆碱及磷脂酰乙醇胺为主，其中也含有磷脂酰甘油或磷脂酰肌醇等。另外，源自蛋黄的卵磷脂中主要含有磷脂酰胆碱及磷脂酰乙醇胺。因此，所使用的磷脂酶C较佳可以无区别地水解上述物质。但，食品中除磷脂以外尚含有大量磷酸酯，如其被水解而使磷酸游离，则会进一步改变该食品的性质，故此作法仍不够好。因此，较佳的选择是不会水解除磷脂外的磷酸酯的磷脂酶C，例如是对甘油磷酰胆碱等类似于磷脂但不含脂质部分的磷酸酯不具酶活性的磷脂酶C。 就此观点而言，所使用的磷脂酶C较佳是不具有磷酸酶活性的蛋白质，也即对作为磷酸酶基质的对硝基苯基磷酸不具分解活性的磷脂酶C。另外，于食品工业中为防止食品变质，较佳作法是于中性至弱酸性pH区域进行各种处理，因此，含有磷脂酶等的酶剂以于该PH区域内具有较高活性者为佳。[6]磷脂酶C在食品工业中的应用磷脂酶C的用途例如有改善于面包的冷冻保存生面团烤制时在面包表面产生的老化、缓和梨皮状表皮及改进食用油的纯化步骤等。于由大豆/菜籽等制造食用油时，由于卵磷脂是造成色泽或口味变差的原因，故必须除去卵磷脂。为达该目的，人们一直在研究如何使用习知的磷脂酶A将卵磷脂部分水解成溶血卵磷脂，而使其变为水溶性后加以除去的方法。然而，此处也可使用磷脂酶C使卵磷脂成为二酰基甘油，而与三酰基甘油共同成为油的一个成分。将此方法应用于食用油的制造步骤中本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种磷脂酶Ｃ，其显示以下的性质，（１）于酸性至中性ｐＨ下显示卵磷脂水解活性，（２）对磷脂酰胆碱的水解活性为１００％时，对磷脂酸的水解活性为３０％以下，以及／或是对甘油磷酰胆碱的水解活性为１５％以下，以及／或是对对硝基苯基磷酸的水解活性为１０％以下，（３）最适ｐＨ为ｐＨ４ｐＨ５的范围，（４）于ｐＨ７时的相对活性为２０％以上，（５）利用ＳＤＳ－ＰＡＧ电泳法的分子量为约８７０００，（６）具有序列编号１～３中任一项所述的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种磷脂酶C，其显示以下的性质，(1)于酸性至中性PH下显示卵磷脂水解活性，(2)对磷脂酰胆碱的水解活性为100%时，对磷脂酸的水解活性为30%以下，以及/或是对甘油磷酰胆碱的水解活性为15%以下，以及/或是对对硝基苯基磷酸的水解活性为 10%以下，(3)最适pH为pH4pH5的范围，(4)于pH7时的相对活性为20%以上，(5)利用SDS-PAG电泳法的分子量为约87000，(6)具有序列编号1 3中任一项所述的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的磷脂酶C，其显示磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰甘油的水解活性，与磷脂酰肌醇的水解活性相比较，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰甘油的水解活性高。3.根据权利要求1所述的磷脂酶C，其中，磷脂酶C由丝状菌产生。4.根据权利要求2所述的磷脂酶C，其中，磷脂酶C由丝状菌产生。5.根据权利要求3所述的磷脂酶C，其中，丝状菌为曲霉(Aspergillus)属。6.根据权利要求4所述的磷脂酶C，其中，丝状菌为曲霉(Aspergillus)属。7.根据权利要求5所述的磷脂酶C，其中，曲霉属丝状菌为米曲霉(Aspergillus oryzae)或溜曲霉(Aspergillus tamarii)。8.根据权利要求6所述的磷脂酶C，其中，曲霉属丝状菌为米曲霉(Aspergillus oryzae)或溜曲霉(Aspergillus tamarii)。9.根据权利要求7所述的磷脂酶C，其中，米曲霉(Aspergi...
【专利技术属性】
技术研发人员：长崎咏子，深泽彻也，小野泰典，
申请(专利权)人：三菱化学食品株式会社，
类型：发明
国别省市：JP
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