一种低温型草菇新菌株的诱变方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种低温型草菇新菌株的诱变方法和应用。本发明专利技术将草菇菌丝接种在含有氯化锂的固体培养基上，并复合照射紫外线，经0℃低温反复处理筛选，获得诱变株，进行出菇实验，得到低温草菇菌株。本发明专利技术方法能有效地诱变草菇菌丝，获得低温的草菇新菌株。本发明专利技术为草菇的遗传育种开辟了一条成功的新的育种途径-氯化锂紫外线同时复合诱变，同时也为其他食用菌的诱变提供技术借鉴。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食用菌诱变育种
，具体涉及一种低温型草菇新菌株的一种特 殊诱变方法和应用。
技术介绍
草菇是一种食用菌，营养丰富，味道鲜美，深受广大消费者喜爱。草菇是典型的热带高温型食用菌，菌丝对低温的抵抗力差，对环境条件的变化尤 其是温度的变化很敏感当平均气温在27°C以下时，草菇子实体难以形成，极不利于草菇 的生长发育，极大地影响着草菇的产量和品质，有时甚至造成绝产。故在我国长江以北地区 适应期较短，极大地制约了草菇的栽培范围。同时，草菇存在着冷害，即在4°C的低温条件下 保存，菌丝会发生自溶而导致菌种死亡和子实体发软、液化直至腐烂。这给草菇的菌种保存 和产后保鲜带来了极大的困难。此外，草菇的生物学效率低。因此，培育高产低温的草菇新 品种就显得尤为重要。然而，草菇为同宗结合真菌，具有很复杂的生活史，菌丝没有锁状联 合，杂种选择缺乏标记，这给草菇的杂交育种带来极大的困难，长期以来草菇产业的优良菌 株十分贫乏。现有技术关于草菇诱变国内对于草菇的诱变只有采用单一方法的诱变，如紫外诱 变或化学试剂诱变，诱变结果不稳定。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有草菇诱变技术的不足，提供一种新的复合诱变方法，使 草菇基因产生变异，结合合适的o°c低温筛选，从而获得稳定遗传的低温型草菇新菌株。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现提供一种低温型草菇新菌株的诱变方法，包括以下步骤(1)将草菇菌丝块接种到含有0. 6% (W/V)氯化锂的固体PDSA平板上；所述草菇菌丝块优选0. 1 X 0. Icm大小；具体是可将32°C恒温培养箱培养3d的草 菇表面菌丝刮去，切取中上部0. 1X0. Icm大小的薄菌丝块接种到含有0.6% (W/V)氯化锂 的固体PDSA平板。(2)将步骤(1)接有菌丝块的含氯化锂的固体PDSA平板置于紫外光线下照射处理 后避光培养；优选将接有菌丝块的含氯化锂的固体PDSA平板置于距离15W紫外灯管的30cm处 照射50min，每个水平做三组平行，用锡箔纸包好，避光30°C培养3d。所述紫外灯照射之前 先打开预热约20min，使光波稳定。(3)将经步骤(2)处理后恢复生长的草菇菌丝体切割成薄块，转接到新的PDSA平 板，并置于0°c低温处理36 48h，28 33°C正常培养进行筛选。优选地，将恢复生长的草菇菌丝体切割成0. 1X0. Icm大小的薄块。(4)将步骤(3)中存活的草菇菌丝块继续切割成薄的小菌块，转接至新鲜的PDSA3平板上，并按步骤(3)中方法筛选。存活的菌丝用相同的方法进行重复筛选，最后能存活的 菌丝即为诱变株；优选重复筛选3 6次。在本专利技术方法中，所用的培养基为常规的草菇菌丝培养基，配方为PDSA 去皮马铃薯 200g，葡萄糖 20g, KH2POJg, MgSO4L 5g，维生素 B15 10mg，琼 脂20g，水1升。含0.6% (W/V)氯化锂固体培养基配方为去皮马铃薯200g，葡萄糖20g， KH2POJg, MgSO4L 5g，维生素 B15 10mg，氯化锂 6g，琼脂 20g，水 1 升。本专利技术的方法能有效地使草菇菌丝体发生变异，因此也适用于其他食用菌的菌丝 体的诱变，如金针菇、杏鲍菇、平菇等。紫外线是一种非电离辐射，能引起DNA链的断裂、DNA分子内和分子间的交联、核 酸与蛋白质的交联，特别是形成嘧啶二聚体，阻碍DNA双链的解链、复制和碱基的正常配 对，从而导致基因突变。由于紫外诱变时存在光复活作用，因此单独紫外诱变效果不明显。 氯化锂是一种碱金属卤化物，能导致AT-GC碱基对的转换或导致碱基的缺失，单独使用时 也没有明显的诱变效果。通常采用两种方法的结合，即先进行紫外诱变后获得的诱变菌株 再使用LiCl进行诱变或先使用LiCl诱变获得诱变菌株后在进行紫外诱变，然而采用这种 方式的组合诱变非但没有使草菇突变株的耐寒性增强，有时还使已经获得的突变株耐低温 能力丧失。本专利技术经过创造性的实验总结得到新的适宜的诱变方案，产生了以下有益效果本专利技术方法采用紫外、LiCl以及其他诱变剂的单项诱变以及常规组合两种不同的 诱变实验，未能获得预期的耐寒草菇新菌株。经过长期大量的实验研究和总结分析，本专利技术 提出本专利技术技术方案并成功地获得优良的耐低温新菌株，按本专利技术方法将出发菌株直接接 种在含有0. 6% LiCl培养基上，同时采用紫外照射50min，再经过3 6次反复的0°C低温 处理，获得能稳定遗传的耐低温草菇突变株。本专利技术填补食用菌有效诱变育种的空白，为食 用菌的有效诱变育种提供科学理论依据。附图说明图1是V138草菇菌丝经过紫外和氯化锂复合诱变后，经0°C低温处理48h后在 32°C温度下生长的结果；图2本专利技术诱变株R6能在18°C温度下生长(图左，图中为培养3d的菌落)，而对 照株V138在这个温度下不能生长(图右)图3诱变得到的新菌株子实体4诱变菌株R6出菇实验5对照菌株V138在16°C低温测试6诱变菌株R6子实体在16 °C低温测试7是草菇菌丝经过紫外和氯化锂复合诱变后，经0°C低温处理36h后在温 度下生长的结果；图8诱变株R5能在18°C温度下生长(图左，图中为培养3d的菌落)，而对照株 V138在这个温度下不能生长(图右)图9诱变得到的新菌株R5子实体图图10诱变株R5出菇实验11对照菌株V138在16°C低温测试12诱变菌株R5子实体的在16°C低温测试13是采用AFLP技术对诱变得到的新菌株R5和R6与对照V138在DNA水平的差异鉴定结果具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本专利技术。下述实施例中所使用的实验 方法如无特殊说明，均为本
现有常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明， 均为可从商业途径得到的试剂和材料。V138为广州市主栽品种，由广州市白云区农业科学 实验中心提供，相关信息可见食用菌杂志插页介绍。实施例1(1)按照常规方法将V138菌种接种于PDSA平板上，在32°C恒温培养箱培养3d，刮 去平板上的草菇表面菌丝，切取中上部0. 1X0. Icm大小的薄菌丝块接种到含有0.6% (W/ V)氯化锂的固体PDSA平板上；所述含0.6% (W/V)氯化锂固体培养基配方为去皮马铃薯200g，葡萄糖20g， KH2P043g, MgSO4L 5g，维生素 B15 10mg，氯化锂 6g，琼脂 20g，水 1 升。(2)先打开紫外灯预热约20min，使光波稳定。将接有菌丝块的含氯化锂的固体 PDSA平板置于距离15W紫外灯管的30cm处照射50min，每个水平做三组平行，用锡箔纸包 好，避光30°C培养3d。(3)将经步骤⑵处理后恢复生长的草菇菌丝体切割成0. 1X0. Icm大小的薄块， 转接到新的PDSA平板，并置于0°C低温处理4 后正常培养进行筛选；本实施例草菇置于 0°C低温处理4 后在32°C温度下生长的结果见附图1 ；如附图1所示，本专利技术方法同时使用紫外线和LiCl对草菇V138进行复合诱变，经 过o°c低温反复处理与筛选，没有突变的或负突变的菌丝不能存活，从而筛选出遗传稳定的 耐低温的草菇诱变株。附图1显示，菌丝体发生变异后能在0°c低温处理4 后存活(图中 箭头所指)，而没有变异的菌丝经O °C低温本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种低温型草菇新菌株的诱变方法，其特征在于包括以下步骤：（１）将草菇菌丝块接种到含有０．６％（Ｗ／Ｖ）氯化锂的固体ＰＤＳＡ平板上；所述含０．６％（Ｗ／Ｖ）氯化锂固体培养基配方为：去皮马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４３ｇ，ＭｇＳＯ４１．５ｇ，维生素Ｂ１５～１０ｍｇ，氯化锂６ｇ，琼脂２０ｇ，水１升；（２）将步骤（１）接有菌丝块的含氯化锂的固体ＰＤＳＡ平板置于紫外光线下照射处理后避光培养；（３）将经步骤（２）处理后恢复生长的草菇菌丝体切割成薄块，转接到新的ＰＤＳＡ平板，置于０℃低温处理后正常培养进行筛选；所述ＰＤＳＡ平板组成为：去皮马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４３ｇ，ＭｇＳＯ４１．５ｇ，维生素Ｂ１５～１０ｍｇ，琼脂２０ｇ，水１升；（４）将步骤（３）中存活的草菇菌丝块继续切割成薄的小菌块，转接至新鲜的ＰＤＳＡ平板上，并按步骤（３）中方法重复筛选，存活的菌丝即为诱变株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林俊芳，游丽容，郭丽琼，曾志忠，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81