本发明专利技术涉及利用核苷酸序列鉴别药用植物的方法，具体涉及药用植物的rDNA?ITS-D3区的核苷酸序列在建立药用植物DNA条形码鉴别系统中的应用。该应用包括以下步骤：首先检测药用植物的ITS-D3区的核苷酸序列，建立DNA条形码数据库，然后检测待鉴定样品的ITS-D3区的核苷酸序列，再将测定得到的核苷酸序列与DNA条形码数据库中的ITS-D3区的核苷酸序列一起构建聚类树，根据聚类树确定待鉴定样品与DNA条形码数据库中亲缘关系最近的药用植物并比较它们的ITS-D3区核苷酸序列差异，然后以数据库中与待鉴定样品亲缘关系最近的药用植物的物种名称为参考，结合形态特征等信息确定待鉴定样品的物种名称。本发明专利技术所述的DNA条形码具有引物通用性好、序列比对准确、物种区别能力强的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及包含核酸的检测和应用方法，具体涉及利用核苷酸序列鉴别药用植物的方法。
技术介绍
药用植物是中药材的原植物，是一些具有保健和药用价值的植物物种。据统计，我国有11146种药用植物(占全部中药资源的87%)，分属383科，2309属。对这一万多种药用植物进行快速、准确鉴定是摆在我国中医药工作者面前的一项紧迫而艰巨的任务。药用植物现有的鉴别方法主要根据形态特征来鉴别，通过采集待鉴定样品各器官(如花、果实、 种子、根、茎、叶)或组织的形态特征，查阅药用植物文献资料、图片及标本，对照比较后得出鉴定结果。这一方法易受植物生长发育阶段、环境条件及鉴定人员的经验影响，鉴定效率较低，而且对一些形态相似的药用植物容易判断错误。随着现代分子生物学特别是DNA测序技术的迅速发展，国际上开始发展DNA条形码技术(DNA barcoding)来鉴别物种。DNA条形码技术是以物种细胞中的一段短的标准的 DNA区域作为条形码标记，对生物物种进行准确、快速、自动鉴定的技术。该技术直接分析植物的基因型而非表现型，鉴别结果不受环境因素、样品形态和材料来源的影响，可以确保药材的基原真实。目前国际上已采用CBOL植物条形码工作组(CBOL Plant Working Group.，A DNA barcodefor land plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009，106 :12794-12797.)提出的以质体基因matK+rbcL组成的双位点植物DNA条形码方案。使用时，用户采用通用引物PCR 扩增matK和rbcL两个位点并测序，将获得的matK和rbcL序列提交到生物条形码数据库 BOLD (http://www. boldsystems, org)进行查询，即可获得样品的生物分类信息。但是这一标准方案在鉴别植物物种时尚存在以下缺点1.需要测试matK和rbcL两个位点，工作量大，成本较高；2. rbcL虽然有通用引物，但序列在物种中进化速率较慢，而matK虽然序列进化速率较快，但缺乏通用引物，这些缺点使matK+rbcL只能区别约70%的植物物种，鉴别能力不理想。植物核糖体DNA(rDNA)通常呈18S-5. 8S-26S顺反子排列于染色体上，在基因组中高度重复(几百至几千次)。位于18S与5. 8S之间的内转录间隔区I(ITSl)以及位于 5.8S与26S之间的内转录间隔区2(ITS2)因具有较高的序列变异速率，已被广泛用于植物系统发生、遗传多样性等研究(Alvarez，I.，Wendel，J. F.，2003. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. Mol. Phylogenet. Evo 1. 29 :417-434.)。最近，一些学者认为ITS2适合作为植物DNA条形码位点，用来区别不同植物物种(Shilin Chen, Hui Yao, Jianping Han, Chang Liu, Jingyuan Song, Linchun Shi, Yingjie Zhu, Xinye Ma, Ting Gao,Xiaohui Pang,Kun Luo,Ying Li, Xiaocheng Jia, Yulin Lin, Christine Leon. Validation of the ITS2Region as a Novel DNA Barcode for Identifying MedicinalPlant Species. PL0S0NE. 2010,15 (1) :e8613)。但是单独采用 ITS2 作为植物 DNA 条形码存在以下缺点1. ITS2序列在许多物种中存在多个不同的拷贝，需对PCR产物进行克隆并挑取多个阳性克隆测序；2.由于缺少保守区，ITS2序列在分类广泛的物种中难以准确比对。Kuzoff P K等研究发现植物核糖体大亚基DNAQ6S rDNA)上存在12个扩展区(D1-D12)，这些扩展区的序列变异速率比位于扩展区之间的保守区快6. 4到10. 2倍 (Kuzoff P K, SweereJ A, Soltis D E, Soltis P S. , Zimmer E A. , The phylogenetic potential of entire 26SrDNA sequences in plants. Molecular Biology and Evolution, 1998，15 :251-263.)。目前，26S rDNA已经应用于植物系统发生研究(Douglas Ε.Soltis, Anne Ε.Senters, MichaelJ. Zanis, Sangtae Kim, James D. Thompson, Pamela S.Soltis,Louis P. Ronse De Craene,Peter K. Endress and James S. Farris. Gunnerales are sister to other core eudicots amplications for the evolution of pentamery. American Journal of Botany，2003，90 :461-470.)，但尚未见将 ^S rDNA上存在的扩展区用于植物(含药用植物)鉴别的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种药用植物ITS-D3区核苷酸序列新用途。本专利技术所述的ITS-D3区核苷酸序列是指核糖体DNA(rDNA)上的一段DNA序列， 由rDNA内转录间隔区ITS(包含ITS1-5. 8S-ITS2)与^S D1-D3构成，其全部区域包含 ITS1-5. 8S-ITS2-D1-D2-D3(图 1)。ITS-D3 区核苷酸序列中的 ITS1、ITS2J6S rDNA 的 D1、 26S rDNA的D2和^S rDNA的D3区域具有序列变异速率快的特点，上述区域在不同物种的药用植物之间或者同一种内不同类型的药用植物之间通常存在碱基差异位点，因此不同物种的药用植物或者同一种内不同类型的药用植物具有不同的ITS-D3序列。并且，ITS-D3 区核苷酸序列中的18S rDNA 3，端、5. 8S、ITS2与^S Dl连接区、26S D1-D2连接区、26S D2-D3连接区和^S D3-D4连接区具有序列变异速率较慢的特点，上述区域在不同物种的药用植物之间或者同一种内不同类型的药用植物之间变化较少，因此上述区域既可以用来筛选PCR检测及测序通用引物，也可以为各种药用植物的ITS-D3区序列比对提供稳定区， 使序列比对能够准确进行。此外，药用植物ITS-D3区序列长度约1400bp，利于PCR扩增与测序。ITS-D3区的核苷酸序列上述特性使其可以作为药用植物DNA条形码，用于药用植物的鉴别。所述的ITS-D3区的核苷酸序列在鉴别药用植物中的用途具体为，药用植物的 ITS-D3区的核苷酸序列在建立药用植物DNA条形码鉴别系统中的应用。本专利技术所述的应用中，所述的药用植物的ITS-D3区的核苷酸序列由以下本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．ｒＤＮＡ ＩＴＳ－Ｄ３区核苷酸序列在建立药用植物ＤＮＡ条形码鉴别系统中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈蔚文，段中岗，詹若挺，杨锦芬，何瑞，徐晖，
申请(专利权)人：广州中医药大学，惠州学院，
类型：发明
国别省市：81
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