本发明专利技术公开了大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物、探针及检测方法，本发明专利技术设计了适用于大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR快速检测的引物和寡核苷酸探针，克服了现有形态学鉴定方法检测周期长、需要制作玻片标本和需要丰富经验的缺点，也克服了现有的分子检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、特异性不强、重复性不好等缺点；由于本发明专利技术检测快速、特异性强，特别适用于口岸检疫等时效性要求较强的场合使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物、探针及检测方法。
技术介绍
大蒋臀级輪喻Planococcus minor (Maskell)是“中华人民共和国进出境植物检疫性有害生物名录”中的有害生物，同时也是欧洲、美洲等许多国家或地区十分关注的检疫性有害生物。该虫在亚洲、非洲、美洲的许多国家或地区广泛分布，已记录寄主植物多达60 余个科共250余种，为害多种水果、林木和观赏植物。主要寄主植物有榴莲、甘橘、葡萄、芒果、香蕉、人心果、西瓜、甜瓜、咖啡、可可、大豆、玉米、马铃薯、观赏花卉植物等。大洋臀纹粉蚧极易随上述寄主植物传入我国，对我国的农业生产构成潜在威胁，因此，需要在口岸检疫部门严格加强检疫工作，防止该虫传入我国。在蚧虫鉴定中，只有成熟、完整的雌成虫才能进行准确的形态鉴定，若口岸截获到若虫，必须花费较长时间将其饲养为成虫；若截获到不完整的死虫，根本无法鉴定其种类。 蚧虫鉴定前，需先将其制作成玻片标本。玻片标本制作的技术性较强，制作人员需经专门培训，才能制作出合格的标本。蚧虫鉴定十分困难，需要经验丰富的蚧虫专家才能准确鉴定其种类。本专利技术弥补了蚧虫形态学鉴定的不足，可以更为快捷、准确地鉴定出口岸截获的蚧虫是否为大洋臀纹粉蚧。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物、探针及检测方法，旨在解决蚧虫形态鉴定耗时长、鉴定困难的问题。本专利技术的技术方案如下一种用于检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ NO. 1 和 SEQ NO. 2 所示。一种用于检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR的MGB探针，其中，所述MGB探针是一段两端分别用不同的染料标记的寡核苷酸，在5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭基团和一个MGB基团，所述寡核苷酸的序列如SEQ NO. 3所示。所述的用于检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR的MGB探针，其中，所述报告荧光基团为荧光染料FAM，所述淬灭基团为非荧光淬灭基团。一种检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR方法，其中，包括以下步骤1)先对大洋臀纹粉蚧及其近似种转录间隔区进行序列测定及比较分析，分别找出大洋臀纹粉蚧不同于其它近似种的独有的碱基位点，然后设计用于大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR 检测的上游引物、下游引物和MGB探针；2)提取待测样品DNA;3)设置实时荧光PCR 的反应体系5 μ 1 2XTaqMan Gene Expression Master Mix,IOpM的上游引物和下游引物各0. 25 μ 1，IOpM的MGB探针0. 2 μ 1，待测样品DNA 1 μ 1，加水补足总体积10μ 1 ；同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照；4)进行实时荧光PCR反应，并检测荧光信号反应条件为50°C，2min；95IOmin ； 950C，IOs ；600C，Imin ；40 个循环；5)根据荧光信号的检测结果，判断是否为大洋臀纹粉蚧。所述的检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR方法，其中，所述阳性对照为大洋臀纹粉蚧DNA，阴性对照为南洋臀纹粉蚧DNA、甘蔗簇粉蚧DNA、新菠萝灰粉蚧DNA、李比利氏灰粉蚧DNA、气生根粉蚧DNA、双条拂粉蚧DNA，空白对照为去离子水。本专利技术的有益效果设计了适用于大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR快速检测的引物和寡核苷酸探针，克服了现有形态学鉴定方法检测周期长、需要制作玻片标本和需要丰富经验的缺点，也克服了现有的分子检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、特异性不强、重复性不好等缺点；由于本专利技术检测快速、特异性强，特别适用于口岸检疫等时效性要求较强的场合使用。附图说明图1是本专利技术实施例中实时荧光PCR检测大洋臀纹粉蚧的荧光信号结果图。 具体实施例方式为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本专利技术进一步详细说明。TaqMan MGB探针实时荧光PCR是在反应体系中加入一条荧光。TaqMan MGB探针是一段两端分别用不同的染料标记的寡核苷酸，即在5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个非荧光淬灭基团和一个MGB基团。当探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被非荧光淬灭基团吸收。在PCR扩增时，加入一对引物的同时加入一条这种特异性的荧光双标记探针，TaqMan MGB探针同PCR产物杂交，在延伸阶段，Taq酶的5’端到3’端的外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和非荧光淬灭基团分离，报告荧光基团染料发出的荧光不再转换给非荧光淬灭基团，导致荧光量的增加，荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如果以每一个循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以PCR循环数为横坐标作图，可得到一条连接每一个循环后荧光值的曲线，即扩增曲线。当样品中含有所要检测的靶核酸序列时，所得到的曲线呈“S”形；而当样品中不含靶核酸序列时，则没有发生PCR扩增，探针不被水解，也就检测不到荧光信号，扩增曲线为一水平线。利用上述TaqMan MGB探针，本专利技术提供的大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR的检测方法，包括如下步骤(1)先对大洋臀纹粉蚧及其近似种转录间隔区(ITS)进行序列测定及比较分析，分别找出大洋臀纹粉蚧不同于其它近似种的独有的碱基位点；(2)设计大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR检测的引物和寡核苷酸探针；(3)对所设计的探针进行筛选及反应体系和反应条件的优化，筛选出优化的引物和探针，并优化出合适的反应体系和反应条件；(4)加入上述的引物、探针进行大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR反应；(5)根据实时荧光PCR结果，判断检测样品是否为大洋臀纹粉蚧。用于大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR检测的引物，其序列(SEQ ID NO. 1-2)如下 COI- PM-F :5’ -TGCTATTCCTACAAGAATTAAAATCTTTAGA-3’ ；COI- PM-R 5' -GACGGGGTATTCCATTTATTCCT-3，。用于大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其包括特异性检测大洋臀纹粉蚧的iTaqMan MGB探针和特异结合的寡核苷酸序列，其序列(SEQ ID NO. 3)如下COI-PM-MGB FAM-CAATTGGATTCATCATTATAT-MGB。其中，MGB探针的5’端用荧光染料FAM作为报告荧光基团，3’端的MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度，同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团。采用上述检测方法的结果判定标准是1)若定量PCR仪检测到以大洋臀纹粉蚧 DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号有明显增长，则表示所检测的蚧虫是大洋臀纹粉蚧；2)若定量PCR仪检测到以大洋臀纹粉蚧DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果报告荧光也没有荧光信号增长，则表示所检测的蚧虫不是大洋臀纹粉蚧。实施例1引物和探针的准备对大洋臀纹粉蚧及其近似种本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光ＰＣＲ引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如ＳＥＱ ＮＯ．１和ＳＥＱ ＮＯ．２所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ NO. 1和SEQ NO. 2所示。2.一种用于检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR的MGB探针，其特征在于，所述MGB探针是一段两端分别用不同的染料标记的寡核苷酸，在5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭基团和一个MGB基团，所述寡核苷酸的序列如SEQ NO. 3所示。3.根据权利要求2所述的用于检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR的MGB探针，其特征在于，所述报告荧光基团为荧光染料FAM，所述淬灭基团为非荧光淬灭基团。4.一种检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR方法，其特征在于，包括以下步骤1)先对大洋臀纹粉蚧及其近似种转录间隔区进行序列测定及比较分析，分别找出大洋臀纹粉蚧不同于其它近似种的独有的碱基位点，然后设计用于大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR 检测的上游引物、下游引物和MGB探针；2...
【专利技术属性】
技术研发人员：焦懿，徐浪，余道坚，陈志粦，康林，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：94
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