溶解和结合荚膜多糖的疫苗制造技术

沉淀的细菌荚膜多糖可以通过应用溶剂酒精而有效的再溶解。本发明专利技术提供了一种提纯细菌荚膜多糖的方法，它包括的步骤有（ａ）沉淀所述多糖，接着（ｂ）用乙醇使沉淀的多糖增溶。步骤（ａ）中可应用ＣＴＡＢ。优选经水解和筛分后获得的材料可以连接到载体蛋白上而制成疫苗。同样，在包含来自血清组Ａ和Ｃ的多糖的疫苗中，本发明专利技术指出ＭｅｎＡ糖和ＭｅｎＣ糖的比例（ｗ／ｗ）是＞１的。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及疫苗领域，尤其涉及抗脑脊膜感染和疾病的疫苗。
技术介绍
脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria memingitidis)是革兰氏阴性的人类致病菌。它寄生在咽部，导致脑脊膜炎并且有时不发生脑脊膜炎而导致败血病。它和淋病奈瑟球菌紧密相关，但明显和脑膜炎双球菌区别的特征是，存在一种多糖荚膜，它存在于所有的致病脑膜炎双球菌中。基于有机体的荚膜多糖，12种脑膜炎奈瑟氏球菌血清组已经被确认(A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。A组经常是sub-Saharan非洲皮肤疾病中所含有的致病菌。血清组B和C是美国和大多数发达国家绝大多数病例的致病菌。血清组W135和Y是美国和其它发达国家剩余病例的致病菌。来自脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖典型的配制方法包括步骤为沉淀(例如应用阳离子洗涤剂)、乙醇分馏、冷石碳酸提取(除去蛋白质)以及超离心(除去LPS)。来自血清组A、C、Y和W135的荚膜多糖四价疫苗已经知道很多年了并且已经批准应用于人类。虽然在青少年和成年人中有效，它引起低的免疫应答和较短的保护时间，不能应用于婴儿。这是因为多糖是T细胞独立的抗原，产生不能提高的较弱免疫应答。在这种疫苗中的所述多糖不共轭并以1∶1∶1∶1的比例存在。MENCEVAX ACWYTM各自包含50μg从冻干形式重组获得的提纯多糖。共轭血清组C寡糖也批准应用于人类。然而仍需要发展针对血清组A、W135和Y的共轭疫苗，并生产它们。
技术实现思路
本专利技术提供了一种提纯细菌荚膜多糖的方法，它包括的步骤有(a)沉淀所述的多糖，接着(b)用乙醇使沉淀的多糖重新溶解。所述的多糖可以用来配制疫苗，如轭合疫苗，尤其是针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、W135和Y的疫苗沉淀和乙醇溶解本文知道了很多沉淀可溶性多糖的技术。优选的方法是应用一种或多种阳离子洗涤剂。所述洗涤剂优选的通常有以下式 其中R1，R2和R3相同或不同，各自代表烷基或芳基；或R1和R2与其所结合的氮原子一起形成一种5-或6-元的饱和杂环，R3代表烷基或芳基；或R1，R2和R3与其所结合的氮原子一起形成一种5-或6-元的杂环，氮原子不饱和，R4代表烷基或芳基，X-代表阴离子。在所述方法中特别优选的洗涤剂是四丁铵盐和十六烷基三甲铵盐(例如溴盐)。十六烷基三甲基溴化铵(‘CTAB’)特别优选。CTAB也可以是溴化十六碳烷基三甲铵、十六烷基三甲基溴化铵(cetrimonium bromide)、塞太弗伦和Centimide。其它的洗涤剂包括海地美溴铵(hexadimethrine bromide)和溴化十四烷基三甲铵盐。荚膜多糖在培养过程中释放入介质。相应的，用来沉淀的初始材料典型的会是来自离心细菌培养物的上层清液或是浓缩的培养物。沉淀的步骤也许对于多糖来说是有选择性的，但它也会典型的同时沉淀其它组分(例如蛋白质、核酸等等)。沉淀的多糖可以通过在溶解之前的离心而收集。在沉淀之后，所述多糖(典型的以阳离子洗涤剂复合物的形式)重新溶解。为了使污染物(例如蛋白质、核酸等)最少化，要优选的应用对于所述多糖有相对选择性的溶剂。已经发现乙醇在这方面有优势，并且它对于所述的CTAB-多糖复合物是高度选择性的。其它较低的醇也可以应用(例如甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丙醇、二醇等等)。所述乙醇优选的加入到多糖沉淀中而产生的最终乙醇浓度(基于乙醇和水的含量)为50％和95％之间(例如大约是55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或大约90％)，优选的是在75％和95％之间。所述最适宜的最终乙醇浓度依赖于获取多糖的细菌血清组。所述乙醇可以纯的形式或用以可混溶的溶剂(例如水)稀释的形式加入到多糖中。优选的溶液是乙醇∶水混合物，优选的比例是在大约70∶30和95∶5之间(例如75∶25，80∶20，85∶15，90∶10)。和配制荚膜多糖的传统方法相比，乙醇提取后所述的两个沉淀步骤更快更简单。和在参考资料9中描述的方法相比，所述方法应用阳离子洗涤剂比阴离子洗涤剂多。和参考资料10所述的方法不一样，所述多糖更多的是应用乙醇重新溶解，而不是通过应用钙或镁盐离子交换。和参考资料11所述的方法不一样，沉淀不需要惰性多孔载体。而且，和前面的技术方法不同，应用酒精来重新溶解多糖，而不是将它沉淀。所述细菌荚膜多糖通常来自奈瑟氏菌属。优选的来自脑膜炎奈瑟氏球菌，包括血清组A，B，C、W135和Y。优选的血清组是A、W135和Y。所述方法也适合配制来自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(尤其是B型，或’hib’)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌)的荚膜多糖。进一步溶解多糖的过程在重新溶解后，将进一步处理多糖来除去杂质。这在甚至较小的污染都不能接受(例如人类疫苗产品)的情况中是尤其重要的。这将典型的包括一或多步的过滤。可以应用深度过滤。这对净化特别有用。可以应用通过活性碳的过滤。这对于除去色素和示踪有机物是有用的。它可以重复进行直至，例如OD275nm＜0.2。可以应用筛分过滤(size filtration)和超滤。一旦过滤除去了杂质，可以将所述多糖沉淀来作进一步的处理和/或加工。这个可通过交换阳离子(例如加入钙或钠盐)方便的完成。所述多糖可以被化学修饰。例如，它可以被修饰以封固基团来替代一个或多个羟基。这对于MenA特别有用。来自血清组B的多糖可以是N-丙酰。所述(任选修饰)多糖将典型的水解以形成寡糖。优选的实施这个将产生少于30的寡糖的最终平均聚合度(DP)(例如对于血清组A来说在10和20之间，优选的大概是10；对于血清组W135和Y在15和25之间，优选的是15-20；等等)。在疫苗中应用的多糖优选的是寡糖。DP可以通过离子交换色谱法或比色测定方便的测定。如果进行了水解，水解产物通常为了除去长度短的寡糖而被筛选过。这个可以通过许多的方法来完成，例如在离子交换色谱法后进行超滤。对于血清组A聚合度小于或等于大约6的寡糖优选的被除去，对于W135和Y那些小于大约4的优选的被除去。为了提高免疫原性，本专利技术的多糖或寡糖优选的连接一载体(附图说明图18)。连接到载体蛋白对于儿科(例如参考资料15)的疫苗特别有用，并且它是一项为人熟知的技术。优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，例如白喉或破伤风类毒素。所述CRM197白喉类毒素特别优选。其它合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白质，合成肽，热休克蛋白，百日咳蛋白质，细胞活素，淋巴因子，激素，生长因子，包含多种人类CD4+T细胞抗原决定簇的人工蛋白质，这些抗原决定簇来自多种病菌衍化抗原，来自流感嗜血菌的蛋白质D，来自弯曲杆菌，等。也可能应用载体蛋白的混合物。结合的糖蛋白比例(w/w)优选的是在0.5∶1(例如蛋白质过量)和5∶1(例如糖过量)，更优选的是那些比例在1∶1.25和1∶2.5之间。一种单独的载体蛋白可以运载多种不同的糖类。在和自由载体蛋白连接中可以运用结合。如果需要可以应用任何合适的连接物来进行结合反应。所述糖类典型的在结合之前被激活或使之有功能。激活可包括，例如，氰化试剂(cyanylating reagent)如CDAP(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提纯细菌荚膜多糖的方法，其特征在于，所述方法包括步骤（ａ）沉淀所述多糖，接着（ｂ）用醇使沉淀的多糖重新溶解。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：P科斯坦蒂诺，
申请(专利权)人：启龙有限公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]