本发明专利技术属生物检测领域。黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条，其特征在于：包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述检测线包被有黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物(AFM1-BSA)，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO.C201018的杂交瘤细胞株2C9产生。该试纸条用于检测黄曲霉毒素M1，具有检测快速、操作简单、灵敏度高的特点。
Aflatoxin M1 immune chromatography test paper strip and preparation method thereof
The invention belongs to the field of biological detection. Aflatoxin M1 immunochromatographic strip, which comprises a cardboard, cardboard side from top to bottom paste absorbent pad, pad, pad and detection of the gold standard sample pad, the pad in the adjacent junction overlap and connect the detecting pad with nitrocellulose membrane as the base pad, nitrocellulose membrane set the horizontal top-down quality control line and test line, the detection line is coated with aflatoxin M1- bovine serum albumin conjugate (AFM1-BSA), the control line is coated with Rabbit anti mouse polyclonal antibody; the gold labeled pad lateral coated with monoclonal antibodies against aflatoxin M1 on the gold nanoparticles, the monoclonal antibodies against aflatoxin M1 by the preservation number of CCTCCNO.C201018 hybridoma cell line 2C9. The test strip is used for detecting aflatoxin M1 and has the advantages of fast detection, simple operation and high sensitivity.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物检测领域，具体涉及一种黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条及其制备 方法。
技术介绍
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是一种能引起 人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素(AFT)目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素 Bl为毒性及致癌性最强的物质。黄曲霉毒素Ml是黄曲霉毒素Bl的羟基化代谢产物，也是 一种强致癌物质。当哺乳动物摄入AFBl污染的饲料后，在体内经羟基化会将AFMl分泌于乳 汁当中。奶牛经摄入黄曲霉毒素Bl污染的饲料后产出的牛奶中便含有黄曲霉毒素Ml。由 于黄曲霉毒素Ml相当稳定，巴氏灭菌法也无法将其杀灭，所以检测黄曲霉毒素Ml不仅要检 测动物饲料原料，而且要检测最终产品。为此世界各国都规定了牛乳及其制品中黄曲霉毒 素Ml的最大允许含量并将其作为强制性标准，如中国政府规定牛乳及其制品(消毒牛奶、 新鲜生牛乳、全脂牛奶粉、淡炼乳、甜炼乳、奶油)中黄曲霉毒素Ml的最高允许含量为0. 5 ng/mL0现有技术中常用的黄曲霉毒素检测技术主要有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱 法(HPLC)、免疫学分析法。前两者具有样品前处理步骤繁琐，耗时费力，仪器价格昂贵，需要 专业人员操作等的缺点，而免疫学分析法具有特异性强、样品前处理简单、成本低、对实验 人员和环境的污染危害小等优点。最常用的免疫学分析法有酶联免疫吸附法、纳米金免疫 层析法等。目前已有黄曲霉毒素Ml的ELISA试剂盒问世，如德国拜发R-Biopharm公司以 及美国Abraxis公司等研发的黄曲霉毒素Ml ELISA检测试剂盒。而基于纳米金的免疫层 析快速检测技术因其更短的检测时间和更简单的样品前处理而显示出更大的应用价值和 应用前景。但目前世界上还没有针对黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条问世。因此，研究建立 一种针对黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条对于监控黄曲霉毒素Ml的含量具有很重要的意义 和应用价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条及其制备 方法。该试纸条用于检测黄曲霉毒素M1，具有检测快速、操作简单、灵敏度高的特点。本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案为黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条(见图1和图2)，包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘 贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维 素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述检测线包被有黄曲 霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶联物(AFMl-BSA)，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标 垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗 体由保藏号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株2C9产生。所述的杂交瘤细胞株2C9已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. C201018。其具有序列 表中SEQ Gene No. 1所示的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列 表中SEQ Gene No. 2所示的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞 株2C9分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ Protein No. 1所示的氨基酸序列；轻链 可变区具有序列表中SEQ Protein No. 2所示的氨基酸序列。该抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗 体可以识别黄曲霉毒素Ml，对黄曲霉毒素Ml的50%抑制浓度IC5tl为67 pg/mL。本专利技术采用的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的制备方法，步骤如下(1)采用两步筛选法获得杂交瘤细胞株2C9将BALB/c小鼠经黄曲霉毒素完全抗原 AFMl-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素完全抗原AFMl-BSA作最 后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞第一步 采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞 争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素Ml作为竞争原，选择 吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步 筛选法进行检测，如此重复克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株2C9 ；(2)将获得的杂交瘤细胞株2C9注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收 集该小鼠的腹水，纯化即得抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体。按上述方案，所述的吸水垫长16 18_，宽2 4mm ；检测垫长25 30_，宽2 4mm ；金标垫长6 9mm，宽2 4mm ；样品垫长12 18mm，宽2 4mm，相邻各垫的交叠长度 为1 3mm。按上述方案，所述的吸水垫为吸水纸。按上述方案，所述检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15 20mm，质 控线和检测线的间距为5 10mm。按上述方案，所述检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶 联物(AFMl-BSA)的包被量为75 375ng ；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被 量为50 500ng。按上述方案，所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15 20nm ；所述金标垫上每厘 米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的用量为200 600ng。如上所述的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤(1)吸水垫的制备将吸水纸剪裁即得吸水垫；(2)检测垫的制备 检测线的包被将黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物(AFMl-BSA)配制成0. 1 0. 5mg/mL的包 被液A ；于距离硝酸纤维素膜上沿为15 20mm的位置，用点喷方式将包被液A横向包被于 硝酸纤维素膜上得到检测线，每厘米检测线上所需黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物 (AFMl-BSA)的包被量为75 375ng，然后于37 40°C条件下干燥5 20分钟； 质控线的包被将兔抗鼠多克隆抗体配制成0. 1 0. 5mg/mL的包被液B ；于距检测线5 IOmm的位 置，用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线上所需 兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50 500ng，然后于37 40°C条件下干燥5 20分钟；(3)样品垫的制备将玻璃纤维膜放入封闭液A中浸湿，取出，于37 40°C条件下干燥4 10小时，得样 品垫，然后置干燥器中室温保存；(4)金标垫的制备将玻璃纤维膜放入封闭液B中浸湿，取出，于37 40°C条件下干燥4 10小时，于已 干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液横向 进行喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体为200 600ng， 然后真空冷冻干燥2 6h，置干燥器中室温保存；所述的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株 2C9产生；(5)试纸条的组装在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处 交叠连接，交叠长度为1 3mm本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．黄曲霉毒素Ｍ１免疫层析试纸条，其特征在于：包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述检测线包被有黄曲霉毒素Ｍ１－牛血清白蛋白偶联物，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ｍ１单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素Ｍ１单克隆抗体由保藏号为ＣＣＴＣＣ ＮＯ． Ｃ２０１０１８的杂交瘤细胞株２Ｃ９产生。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，张道宏，张奇，张文，管笛，丁小霞，姜俊，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：83
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