一种检测呕吐毒素的试纸条及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测呕吐毒素的试纸条及其应用。试纸条包括样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）和底板（7），所述反应膜上具有包被有呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线（5）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6），所述结合物释放垫（2）喷涂有呕吐毒素单克隆抗体-胶体金标记物。本发明专利技术还提供了一种应用上述呕吐毒素试纸条检测谷物及饲料中呕吐毒素残留的方法。本发明专利技术所提供的试纸条具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。

【技术实现步骤摘要】
一种检测呕吐毒素的试纸条及其应用
本专利技术涉及一种检测呕吐毒素的试纸条及其应用，具体涉及一种用于检测呕吐毒素的胶体金试纸条，其特别适用于谷物及饲料中呕吐毒素残留的检测。
技术介绍
呕吐毒素(vomitoxin)又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，是单端孢菌素烯烃中的一种，它通常是由生长在谷类物品（如小麦、玉米、大麦和秣草）霉菌镰红菌素生成的。呕吐毒素的毒性效应包括：呕吐、不想进食、胃肠炎、腹泻、免疫抑制和血液病。DON广泛存在于全球，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，人和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应。近年来发现DON可能与人类食管癌、IgA肾病有关，对人类及动物的健康构成威胁。人畜摄入了被DON污染的食物/饲料后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。研究表明，DON可能对免疫系统有影响，有明显胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遗传毒性，但无致癌、致突变作用。由于DON的危害严重，引起了各国的普遍重视。谷物及饲料中DON的含量有严格的限量标准。我国谷物、猪配合饲料、犊牛配合饲料、泌乳期动物配合饲料中DON的限量标准为1.0mg/kg，牛配合饲料、家禽配合饲料中DON的限量标准为5.0mg/kg。目前检测呕吐毒素的方法有多种，如薄层色谱法、酶联免疫吸附试验(ELISA）、气相色谱、高效液相色谱、红外光谱分析等。其中，仪器法灵敏、准确，但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测的成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用。因此，针对现有呕吐毒素检测技术上的不足，我们设计了一种用胶体金免疫层析技术检测谷物及饲料中呕吐毒素的方法，该方法特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测，是理想的快速筛选手段，能够更好地满足我国谷物及饲料企业、政府职能监管部门等开展检测工作。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的呕吐毒素残留检测试纸条。本专利技术所提供的检测呕吐毒素残留的试纸条，包括样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）和底板（7）；所述反应膜上具有包被有呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线（5）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6），所述结合物释放垫（2）喷涂有呕吐毒素单克隆抗体-胶体金标记物。所述呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物是由呕吐毒素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。所述呕吐毒素单克隆抗体是以呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，是由呕吐毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。所述样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）依次粘贴在底板（7）上，所述结合物释放垫1/3~1/2被覆盖于样品吸收垫下。所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。本专利技术的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：1）制备喷涂有呕吐毒素单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；2）制备具有包被有呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。具体地说，步骤包括：1）半抗原制备：将呕吐毒素与邻苯二甲酸酐反应得到呕吐毒素半抗原；2）将呕吐毒素半抗原与载体蛋白偶联，得到呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物；3）用呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到呕吐毒素单克隆杂交瘤细胞株；4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；5）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；6）将步骤3）制备的呕吐毒素单克隆抗体加入步骤5）制备的胶体金中，得到呕吐毒素单克隆抗体-胶体金标记物；7）将呕吐毒素单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；8）将呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；9）将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（体积分数）、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；10）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4~30℃条件下可保存12个月。本专利技术的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测谷物及饲料中呕吐毒素残留的方法，它包括步骤：（1）样品前处理；（2）用试纸条进行检测；（3）分析检测结果。本专利技术的呕吐毒素快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及竞争抑制免疫层析分析技术，将呕吐毒素单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的呕吐毒素在流动过程中，与结合物释放垫上的呕吐毒素单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合呕吐毒素单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有呕吐毒素残留。检测时，样品经处理后滴入试纸条孔内，当呕吐毒素在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线（T）和质控线（C）内各出现一条红色条带；如果呕吐毒素在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与呕吐毒素全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。如图2所示。阴性：当质控线（C）显示出红色条带，检测线（T）同时也显示出红色条带，判为阴性。阳性：当质控线（C）显示出红色条带，而检测线（T）不显色，判为阳性。无效：当质控线（C）不显示出红色条带，则无论检测线（T）显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。本专利技术的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本专利技术试纸条检测呕吐毒素残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。附图说明图1为试纸条剖面结构示意图。图2为试纸条检测结果判定图。图3为呕吐毒素半抗原合成图。图4为呕吐毒素半抗原核磁共振氢谱图。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。实施例1呕吐毒素检测试纸条的制备该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：1）制备喷涂有呕吐毒素单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；2）制备具有包被有呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸条。下面分步详细叙述：1、呕吐毒素半抗原的制备30mg呕吐毒素、60m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测呕吐毒素的试纸条，包括样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）和底板（7），其特征在于所述反应膜上具有包被有呕吐毒素半抗原‑载体蛋白偶联物的检测线（5）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6），所述结合物释放垫（2）喷涂有呕吐毒素单克隆抗体‑胶体金标记物。

【技术特征摘要】
1.一种检测呕吐毒素的试纸条，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，其特征在于所述反应膜上具有包被有呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有呕吐毒素单克隆抗体-胶体金标记物，所述呕吐毒素半抗原是由呕吐毒素与邻苯二甲酸酐反应得到，其分子结构式为：2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7)上。3.如权利要求1-2任一项所述的试纸条，其特征在于所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物由呕吐毒素半抗原与载...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯才伟，扶胜，杨学林，贾芳芳，景滢滢，聂雯莹，冯静，孙震，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11