超级细菌NDM-1基因荧光定量PCR检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种超级细菌NDM-1基因的荧光定量PCR检测方法及试剂盒。所用引物和TaqMan探针是根据超级细菌NDM-1基因的保守区域设计的，用以定量检测待测样品中超级细菌的核酸拷贝数。上游引物具有序列表中SEQ?ID?NO：1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ?ID?NO：2的核苷酸序列；所述TaqMan探针具有序列表中SEQ?ID?NO：3的核苷酸序列。本发明专利技术能快速、准确地检测出超级细菌NDM-1基因，对保障人类健康具有重要意义。本发明专利技术对于控制超级细菌传播和人民用药安全意义重大。本发明专利技术的检测方法及试剂盒可用于可疑超级细菌病患者多种样本、环境样本中NDM-1基因的检测，辅助临床超级细菌感染的诊断和治疗，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中细菌的分子生物学检测方法，特别是涉及超级细菌 NDM-I基因的荧光定量PCR检测方法及试剂盒。
技术介绍
超级细菌是一个泛指的概念，是指能够耐多重抗生素的细菌，过去认为的超级细 菌是指耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌和耐万古霉素的肠球菌。最近报道的被媒体称之 为超级细菌的，是指含有NDM-I基因的泛耐药细菌(Kamarasamy K, Toleman MA,ffalsh TR, et al. Emergence of a new antibiotic resistance in India, Pakistan, and the UK a prospective survey. Lancet Infect Di s,2010,10 :597-602)。2010 年 8 月，Lancet, hf. Dis杂志报道，在印度、巴基斯坦和英国发现一些泛耐药的革兰氏阴性细菌，这些细菌 由于含有NDM-I基因(新德里β内酰胺酶1, New Delhi metalIo-β-lactamase 1)，而对 多种抗生素耐药，被称之为“超级细菌”。目前全球已有170多人感染了这种超级细菌，并已 蔓延至美国、加拿大、澳大利亚、比利时、荷兰和日本等国。目前研究发现带有NDM-I基因的 超级细菌主要在住院病人中引起感染，特别是免疫力低下、正常菌群失调的病人中容易引 起感染，感染部位通常为血液、尿道、肺部和伤口等。含有NDM-I基因的超级细菌对人类健康的危害目前还不可估计，但是，监测和检 测含有该基因的细菌，并为临床药物治疗提供依据，对于进一步规范合理用药，预防抗生素 的滥用和耐药性的产生及广泛传播具有重要意义。由于超级细菌出现不久，迄今我国仅有 3例超级细菌阳性病例的报道，所以目前还没有统一的检测方法及商品化的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术首先提供了用于对超级细菌NDM-I基因进行荧光定量PCR检测的方法。本专利技术所提供的荧光定量PCR检测方法，是利用根据超级细菌NDM-I基因的保守 区域设计的引物和TaqMan探针进行的实时荧光定量PCR检测，其中，所述引物的上游引物 具有序列表中SEQ ID NO 1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO 2的核苷酸 序列；所述TaqMan探针具有序列表中SEQ ID NO 3的核苷酸序列。所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团(R)，3’端标记 有淬灭荧光基团⑴)。所述报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQl。检测中，25 μ L荧光定量PCR反应体系可包括=TaqMan探针l.OyL (5pmol/μ L)， 上游引物 1.5“1^(5 11101/^1^)，下游引物2.5“1^(5 11101/^1^)，样品0嫩 5 μ L，Taq DNA 聚 合酶(5U)0.6 μ L，实时荧光PCR缓冲液(2X)12.5yL(用购自Takara公司的IOXbuffer 4 μ L，力口 dNTP 3. 5 μ L禾口 DEPC水5 μ L配制而成)，补充无菌水至25 μ L。荧光定量PCR反应条件可为先防污染37°C 5min ；然后预变性95°C 3min ；最后扩 增95°C 10sec,60°C 40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。所述检测方法还包括标准曲线的建立，方法为用含有目的片段的质粒作为标准品，将其 10 倍系列稀释成 I :1. OX IOltl 拷贝 /UL5II :1·0Χ109 拷贝 /yL ；111 =LOXlO8 拷贝 / μ L ;IV :1. OXlO7 拷贝 / μ L ;V :1. OXlO6 拷贝 / μ L ;VI :1. OXlO5 拷贝 / μ L ；VII 1. OX IO4 拷贝 /μ L ；VIII :1. OX IO3 拷贝 /μ L ;IX :1. OX IO2 拷贝 /μ L ；X 1. OXlO1 拷贝 / μ L ；XI =LOXlO0拷贝/ μ L。将质粒作为模板进行荧光定量PCR检测，得到用于超级细菌 NDM-I基因检测的标准曲线。所述标准曲线的25 μ L荧光定量PCR反应体系与上述相同；荧光定量PCR反应条 件与上述相同。本专利技术的另一目的是提供一种用于对超级细菌NDM-I基因进行荧光定量PCR检测 的试剂盒。本专利技术所提供的试剂盒，包括上述用于对超级细菌NDM-I基因进行荧光定量PCR 检测的引物和iTaqMan探针。其中一种简装试剂盒，包括各自独立包装的超级细菌反应液Iml/管和Taq聚合酶 (5U,每个反应0. 6 μ L) 30 μ 1/管两个试剂管。所述超级细菌反应液为dNIPs、MgCl2、PCR引物和荧光探针的混合液，由12. 5重量 份的2 Xbuffer、l. 5重量份上游引物、2. 5重量份下游引物、1. 0重量份TaqMan探针和1. 9 重量份的DEPC水混合而成；其中2Xbuffer用含MgCl215mM的Takara公司的IOXbuffer 4 μ L、dNTP 3. 5 μ L 禾口 DEPC 水 5 μ L 配制而成。另一种多管试剂盒，除了上述两个试剂管，还包括各自独立包装的强阳性对照品 (10_5稀释度的质粒pBlue-NDM-Ι)、临界阳性对照品(10_8稀释度的质粒pBlue-NDM-1)、DNA 提取液(配方为0. 5% NP40，溶剂为TE缓冲液)及阴性对照品(无菌水)试剂管。本专利技术提供了一种超级细菌NDM-I基因的荧光定量PCR检测方法，公开了其专用 引物和TaqMan探针并提供了专用检测试剂盒。本专利技术是以待检样品中超级细菌的NDM-I 基因为检测对象，准确度及精密度均较好。本专利技术具有以下优点1、首次建立了超级细菌NDM-I基因探针法荧光定量PCR检测方法，利用此检测方 法可以对待测样本中的超级细菌NDM-I基因进行检测。2、本检测方法与超级细菌的其它常规检测方法如细菌的分离培养鉴定、全菌 ELISA法和嵌套式PCR相比，灵敏度和特异性极高，检测效率得到了很大的提高，并且有效 的防止了污染。3、本检测方法与超级细菌的其它常规检测方法，如细菌的分离培养鉴定、全菌 ELISA法和嵌套式PCR相比，具有操作程序简单易用的特点，并可进一步制成检测试剂盒， 操作程序化，适合大面积推广和应用。4、本检测方法不仅能够评价人的超级细菌感染状况，同时也为超级细菌的流行病 学、致病机理等相关领域的研究提供了依据。综上所述，本专利技术能快速、准确地检测出超级细菌，对保障人类健康、控制超级细 菌传播和人民用药安全意义重大。本专利技术的检测方法及试剂盒可用于多种临床样本(痰 液、尿液、血液、鼻咽抽吸物、拭子)中泛耐药细菌NDM-I基因的核酸检测，辅助诊断细菌中 是否含有NDM-I耐药基因，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。附图说明图1为10倍系列稀释pBlue-NDM-Ι质粒标准品的荧光定量PCR扩增曲线图2为超级细菌NDM-I基因的荧光定量PCR检测的标准曲线图3为超级细菌NDM-I基因荧光定量PCR检测的检测应用结果图4为超级细菌NDM-I基因荧光定量PCR检测试剂盒的灵敏度检测结果图5为超本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种超级细菌ＮＤＭ－１基因的荧光定量ＰＣＲ检测方法，是利用根据超级细菌ＮＤＭ－１基因的保守区域设计的引物和ＴａｑＭａｎ探针进行的实时荧光定量ＰＣＲ检测，所述引物的上游引物具有序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的核苷酸序列，下游引物具有序列表中ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：２的核苷酸序列；所述ＴａｑＭａｎ探针具有序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹健荣，张誌，张陆明，颛孙丹丹，
申请(专利权)人：北京金豪制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11