本发明专利技术公开了一种水中沙门氏菌属活体的定量检测方法，该方法根据沙门氏菌的生长特性和invA基因的保守性，采用多管发酵法从水样中初步筛选出以沙门氏菌为主的活体细菌。利用沙门氏菌属通用引物139和141，通过PCR扩增来鉴别沙门氏菌阳性菌落。通过MPN计数方法，定量检测水中的沙门氏菌活体。该方法能够准确检测水中沙门氏菌活体的含量，特异性高，操作简便可行，适用于地表水、污水等多种水样的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及地表水体、污水的检测方法，具体涉及，该方法将多管发酵技术、PCR技术和最大可能数(MPN)计数方法相结合，能够准确的定量检测水中沙门氏菌活体的含量。适合于地表水体、污水等多种水样中沙门氏菌活体的定量检测。
技术介绍
前对于沙门氏菌的检测，可以分为培养法、免疫学检测法和核酸检测法三类。培养法和免疫学检测法通常是根据沙门氏菌的生长特性，采用选择性的培养基使沙门氏菌成为优势菌群，然后基于沙门氏菌的生化特性和菌体表面抗原特性，利用生化反应和抗原-抗体反应的特异性进行沙门氏菌的检测。这些方法大都存在操作复杂、易受干扰、难以定量检测的问题。沙门氏菌属种类极多，其性状在水环境中时常会出现变异，常常出现实际生化反应结果与沙门氏菌鉴别表中的类型不相符的情况，造成检测失败。核酸检测法是利用PCR 技术对沙门氏菌保守的基因片段进行检测来实现准确检测的目的，然而其最大的弊端是无法区分活体和已死亡的菌体，单纯利用PCR技术无法深入研究水环境中沙门氏菌对人体健康的影响。因此，目前还没有一种适用于水中沙门氏菌活体的定量检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案，其特征在于，按下列步骤进行 步骤一，样品采集用预先灭菌的采样瓶采集水样1L，水样采集后立即放入冰盒内保存，6h内进行检测； 步骤二，水样的浓缩对于沙门氏菌浓度低的水样，真空抽滤IOOOmL水样通过微孔滤膜，过滤完毕后取出滤膜，置于已灭菌的烧杯中，加入IOmL磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的pH值为7. 4，用磁力搅拌洗脱滤膜30min ；弃滤膜，保存洗脱产物，取洗脱产物lmL，加入到9mL超纯水中，混勻后再取出lmL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到ΙΟΛΚΓ1和10_2三种稀释度的样品； 对于沙门氏菌浓度高的水样，取原水lmL，加入到9mL超纯水中，混勻后再取出lmL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到ΙΟΛΚΓ1和10_2稀释度的样品； 步骤三，水样前增菌将1O-0、lO-1和10_2这三种稀释度的样品分别加入前增菌液混勻，每个稀释度做5份，放入37°C恒温培养箱中培养Mh ； 步骤四，选择性增菌将各个稀释度样品的前增菌产物ImL转入到100 mL选择性增菌液中并混勻，在42°C下进行选择性增菌培养Mh ；步骤五，平板划线分离挑取选择性 增菌产物，分别在XLD平板和BS平板上划线分离和培养，其中，XLD平板在 37°C下培养24h，BS平板在37°C下培养48h ； 步骤六，阳性菌落的鉴定培养完毕，观察在XLD和BS平板上生长的菌落形态，分别挑取不同形态的菌落，置于 PCR反应管中，以沙门氏菌属通用引物进行扩增，扩增片段长度为284 bp ；并对PCR产物在 IOOV下电泳40min，观察在284 bp位置上是否有明亮的扩增条带出现，若有，则该菌落为沙门氏菌阳性；所述的沙门氏菌属通用引物包括上游引物139和下游引物141，其中 上游引物 139 的序列为5，- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’ ； 下游引物 141 的序列为5，- TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3，；步骤七，鉴定XLD和BS两种平板上的阳性菌落，并进行互补计数，对于每个稀释度的样品，对应的XLD平板和BS平板只要有其一是阳性平板，则该稀释度即为阳性；以阳性组合的方式记录平板上阳性菌落的结果，对照MPN表查找对应的MPN值，除以在步骤二中水样浓缩的倍数，得到100 mL水样的沙门氏菌活体含量(MPN/100mL)。所述的PCR扩增的条件是(1 )PCR反应体系总体积25μ ，其中各成分终浓度为引物139和引物141各0. 4 μ mo 1/ L,0. 75U Taq 酶，0· 8 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2 ；(2) PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件为95°C预变性5min ；95°C，30s，65°C， 30s，72°C，30s，进行30个循环；最后72°C延伸4min。本专利技术的水中沙门氏菌活体的定量检测方法，能够定量检测水中沙门氏菌活体含量，并提高检测的特异性，操作简便可行，适用于地表水、污水等多种水样的检测。附图说明图1是沙门氏菌属通用引物的PCR产物电泳图，其中的泳道的标号分别为，M泳道表示DNA marker ；1泳道表示鼠伤寒沙门氏菌；2泳道表示伤寒沙门氏菌(CMCC 50071) ；3 泳道表示大肠埃希菌(ATCC25922) ;4泳道表示金黄色葡萄球菌(ATCC25923) ;5泳道表示金黄色葡萄球菌(ATCC29213) ；6泳道表示铜绿假单胞菌(ATCC27853) ；7泳道表示志贺氏菌； 8泳道表示枯草芽孢杆菌；N泳道表示阴性对照。以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步的详细说明。具体实施例方式1、设备和试剂(1)PCR仪；(2)核酸水平电泳仪；(3)凝胶成像仪；(4)恒温培养箱(5)高压蒸汽灭菌器(6)不锈钢真空抽滤器(7)微波炉(8)0. 22 μ m混合纤维素酯微孔滤膜(9)鼠伤寒沙门氏菌；(10)木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂培养基(XLD)(11)亚硫酸铋琼脂培养基(BS)(12)氯化镁孔雀绿增菌液(13)蛋白胨(14)琼脂糖(15)Tris 干粉(16)Na2EDTA · 2H20(17)核酸染料(18)DNA marker(19)6XLoading buffer(20)Taq酶(21)dNTPs(22)PCR buffer(23)沙门氏菌属通用引物，包括上游引物139和下游引物141；上、下游引物由专业生物工程公司合成。上游引物139的核苷酸序列为5’_ GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA -3'；下游引物141的核苷酸序列为5'- TCATCGCACCGTCAAAGGAACC _3'，特异性扩增片段为 284bp。2、试剂配制(1)前增菌液配制称取8g蛋白胨溶于400mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，定量分装，高压蒸汽灭菌备用。(2)选择性增菌液配制称取24g氯化镁孔雀绿固体干粉溶于SOOmL超纯水中，力口热煮沸至完全溶解，分装，高压蒸汽灭菌备用。(3)XLD平板的制备称取21. 57g XLD培养基溶于400mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，冷却至55°C左右，摇勻，倾注平板，室温冷却备用。(4)BS平板的制备称取19. 84g BS培养基溶于400mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，冷却至55°C左右，摇勻，倾注平板，室温冷却备用。(5)电泳缓冲液的制备称量242g Tris干粉和37. 2g Na2EDTA ·2Η20置于烧杯中， 加入约800 mL的超纯水，57. ImL醋酸，充分搅拌溶解。加超纯水定容至IL后，得到50ΧΤΑΕ Buffer。根据需要，以1 50的比例稀释，即得到IXTAE Buffer，作为电泳缓冲液。(6)琼脂糖凝胶的制备称量1.5g琼脂糖，置于250mL锥形瓶中，加入100 mL IXTAE Buffer，放入微波炉中加热至完全溶解，溶液清澈透明时取出。待稍冷，加入IOyL 核酸染料，混勻后倾倒入已插入梳子的核酸水平电泳槽中。待琼脂糖凝胶完全凝固后即可使用。3、本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法，其特征在于，按下列步骤进行：步骤一，样品采集：用预先灭菌的采样瓶采集水样１Ｌ，水样采集后立即放入冰盒内保存，６ｈ内进行检测；步骤二，水样的浓缩：对于沙门氏菌浓度低的水样，真空抽滤１０００ｍＬ水样通过微孔滤膜，过滤完毕后取出滤膜，置于已灭菌的烧杯中，加入１０ｍＬ磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的ｐＨ值为７．４，用磁力搅拌洗脱滤膜３０ｍｉｎ；弃滤膜，保存洗脱产物，取洗脱产物１ｍＬ，加入到９ｍＬ超纯水中，混匀后再取出１ｍＬ，加入到９ｍＬ超纯水中，依次梯度稀释，得到１０－０、１０－１和１０－２三种稀释度的样品；对于沙门氏菌浓度高的水样，取原水１ｍＬ，加入到９ｍＬ超纯水中，混匀后再取出１ｍＬ，加入到９ｍＬ超纯水中，依次梯度稀释，得到１０－０、１０－１和１０－２稀释度的样品；步骤三，水样前增菌：将１０－０、１０－１和１０－２这三种稀释度的样品分别加入前增菌液混匀，每个稀释度做５份，放入３７℃恒温培养箱中培养２４ｈ；步骤四，选择性增菌：将各个稀释度样品的前增菌产物１ｍＬ转入到１００ ｍＬ选择性增菌液中并混匀，在４２℃下进行选择性增菌培养２４ｈ；步骤五，平板划线分离：挑取选择性增菌产物，分别在ＸＬＤ平板和ＢＳ平板上划线分离和培养，其中，ＸＬＤ平板在３７℃下培养２４ｈ，ＢＳ平板在３７℃下培养４８ｈ；步骤六，阳性菌落的鉴定：培养完毕，观察在ＸＬＤ和ＢＳ平板上生长的菌落形态，分别挑取不同形态的菌落，置于ＰＣＲ反应管中，以沙门氏菌属通用引物进行扩增，扩增片段长度为２８４ ｂｐ；并对ＰＣＲ产物在１００Ｖ下电泳４０ ｍｉｎ，观察在２８４ ｂｐ位置上是否有明亮的扩增条带出现，若有，则该菌落为沙门氏菌阳性；所述的沙门氏菌属通用引物包括上游引物１３９和下游引物１４１，其中：上游引物１３９的序列为：５＇－ ＧＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＧＣＡＡ－３＇；下游引物１４１的序列为：５＇－ ＴＣＡＴＣＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＣＣ－３＇；步骤七，鉴定ＸＬＤ和ＢＳ两种平板上的阳性菌落，并进行互补计数，对于每个稀释度的样品，对应的ＸＬＤ平板和ＢＳ平板只要有其一是阳性平板，则该稀释度即为阳性；以阳性组合的方式记录平板上阳性菌落的结果，对照ＭＰＮ表查找对应的ＭＰＮ值，除以在步骤二中水样浓缩的倍数，得到１００ ｍＬ水样的沙门氏菌活体含量。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张崇淼，王晓昌，船水尚行，
申请(专利权)人：西安建筑科技大学，
类型：发明
国别省市：87
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