鉴定抗阿维菌素小菜蛾种群的方法技术

本发明专利技术“鉴定抗阿维菌素小菜蛾种群的方法”，属于蔬菜害虫的分子鉴定技术。步骤如下：(1)随机捕捉5～15头待测种群的小菜蛾，分别制备每头小菜蛾的cDNA，即10个重复的待测样品；(2)制备小菜蛾敏感种群的cDNA，即阴性对照样品；(3)分别以待测样品、阴性对照样品为模板，进行荧光定量PCR反应；(4)统计计算比较待测样品与阴性对照样品的荧光定量PCR反应产物产量是否具有显著差异；其特征在于：所述荧光定量PCR采用的引物如下：YG-S16：CGTCTACATCCGCATCTTCC，YG-A16CAAGATCGTCAGTCGTCCAA。仅仅需要几头待测小菜蛾即可完成鉴定，具有便捷，准确的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蔬菜害虫的分子鉴定技术，特别是一种。
技术介绍
小菜蛾Plutella xylostella(L.)又名菜蛾，方块蛾，属鳞翅目(Lepidoptera), 菜蛾科(Plutellidae)，世界各地均有分布。在我国20世纪70年代以来逐渐上升为长江流域中、下游地区十字花科蔬菜的主要害虫。小菜蛾主要为害十字花科植物，目前，对其防治以农药防治为主，物理防治和生物防治为辅。而化学防治中又以阿维菌素的使用最为广泛， 主要是由于阿维菌素良好的防治效果和较低的价格决定的。阿维菌素作为一种高效经济的防治小菜蛾的药剂已经在田间使用很长时间。长期大面积反复施用必然导致小菜蛾抗药性产生，目前全国各地均有报道，其中在云南，广东等南方省份尤为严重，小菜蛾对阿维菌素抗性已经达到上千倍。为了有效防治小菜蛾，鉴定小菜蛾种群是否对阿维菌素产生抗性以及抗性程度，对于采取防治措施是否恰当非常有意义，目前鉴定小菜蛾的抗性大多通过生物测定，即采集至少300头小菜蛾，设置5-6个梯度浓度的阿维菌素，然后观察记录小菜蛾的半致死剂量。该方法比较繁琐，需要捕捉相当大数量的小菜蛾才能进行测定。有研究表明位于小菜蛾细胞膜上的GluCl α亚基是阿维菌素的作用受体之一。 GluCl α亚基基因的全长序列已于2008年由本实验室的梁延坡硕士克隆并且已在GenBank 上登录(登陆ID = GQ221939. 1)。GluCl α亚基基因表达量与小菜蛾对阿维菌素的抗性之间的关系，以及如何利用GluCl α亚基基因采用分子检测方法进行小菜蛾抗性群体的鉴定的研究，对于小菜蛾的防治及抗性种群研究具有实用价值和指导性。到目前，并未见到有有效应用GluCl α亚基基因来检测抗阿维菌素小菜蛾种群的方法。
技术实现思路
本专利技术通过设计出特异性引物，运用分子生物学方法和实时荧光定量PCR方法鉴定小菜蛾种群对阿维菌素的抗性情况，仅仅需要几头待测小菜蛾即可完成鉴定，具有便捷， 准确的优点。一种，步骤如下(1)随机捕捉5 15头待测种群的小菜蛾，分别制备每头小菜蛾的cDNA，即10个重复的待测样品；(2)制备小菜蛾敏感种群的cDNA，即阴性对照样品；(3)分别以待测样品、阴性对照样品为模板，进行荧光定量PCR反应；(4)统计计算比较待测样品与阴性对照样品的荧光定量PCR反应产物产量是否具有显著差异；其特征在于所述荧光定量PCR采用的引物如下 YG-S16 CGTCTACATCCGCATCTTCC,YG-A16CAAGATCGTCAGTCGTCCAA。所述小菜蛾敏感种群指对阿维菌素的半致死剂量为0. 05ug/ml以下。所述小菜蛾敏感种群为福建敏感种群。所述荧光PCR的反应体系如下cDNA 1. Oul ；dNTP 2. Oul ;rTaq 酶 0. 2ul ； 10 X Buffer 2. Oul ；IOuM ^ YG-S160. 4ul ； IOuM 的 YG-A160. 4ul ；ddH20 至 20ul ；PCR 程序95 "C, 5. Omin ；95 V 0. 5 min，50-60 V 0. 5min，72 V lmin，35 循环； 72 0C 10min，4°C 停止。本专利技术根据梁延坡在2009提交的GluCl α亚基基因序列，设计了一序列GluCl α 亚基基因的特异性引物，并根据特异性引物对小菜蛾抗性与GluCl α亚基基因表达量之间的关系进行研究，发现GluCl α亚基基因表达量与小菜蛾对阿维菌素的抗性呈正相关。根据这一结果，专利技术人将选得的一对特异性引物F16结合荧光实时定量PCR技术及统计学方法提供一种坚定小菜蛾抗性种群的方法测定小菜蛾的GluCl α亚基基因表达量，并与与阴性对照的基因表达量比较是否具有显著差异，有显著差异说明待测小菜蛾为抗性种群， 从而为进一步的防治手段及用药量提供指导和依据。由于本专利技术的方法的核心是采用分子生物学方法进行定量检测和统计，因此，在检测一个地区或一定区域的田间的小菜蛾是否为抗性种群时，仅仅需要捕捉少数几头做为检测的样品，每头为一个重复，用作荧光定量 PCR的模板，不需要捕捉大量的小菜蛾用于进行阿维菌素致死剂量的测定以判断其是否为抗性种群。本专利技术的方法，需要设阴性对照，即敏感种群小菜蛾作为模板的对照，其一般为在不接触任何药剂的环境下饲养5以上的小菜蛾后代，GluCl α亚基基因表达量高于这类敏感种群且有显著差异的小菜蛾种群说明为阿维菌素选择压环境下的后代，对阿维菌素有抗性，需要调整用药量或者更换药物种类。根据本专利技术的方法，本领域普通技术人员可以采用任何符合这一要求的小菜蛾作为阴性对照。附图说明图1.总RNA电泳图。图2. cDNA经Actin检测电泳结果。图3.福建敏感种群四龄小菜蛾退火温度为50_60°C温度梯度下，F16引物PCR产物电泳结果图4.福建敏感种群蛹期小菜蛾退火温度为50-60°C温度梯度下，F16弓丨物PCR产物电泳结果图5.使用同时设计的其它引物对小菜蛾cDNA进行PCR扩增的产物。从左到右依次为引物F14、F15、F17、F18和F19的电泳结果，每个引物4次重复。图6.同时用其他小菜蛾种群的cDNA模板检测F16海南(HN)种群和广州敏感(GM)种群小菜蛾使用F16和Actin引物PCR产物电泳结果，所得结果与福建敏感小菜蛾种群一致。具体实施例方式1..材料与方法11试验材料福建敏感(FM)和福建抗性(FT)小菜蛾，均为本实验室饲养小菜蛾种群，其中福建抗性种群用阿维菌素持续汰选多代而得，福建敏感种群用无药的甘蓝叶饲喂至少5年而得(其阿维菌素半致死剂量为0. 05ug/ml以下)。海南种群(HN):海南种群小菜蛾为从海南田间采集而得。广州敏感(GM)广州敏感小菜蛾种群为本实验室长期饲养获得。美国种群从美国带回，在实验室用无药的甘蓝叶长期饲喂获得。以上小菜蛾种群及其cDNA，本实验室均有保存，可向公众发放用于验证实验。1.2试验基本情况。首先根据已知的GluCl α亚基基因序列设计小菜蛾特异性的荧光引物，然后提取福建敏感和抗性小菜蛾各龄期总RNA，反转录为cDNA，最后以所得的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，根据所得参数进行基因表达量分析。1. 3试验结果所得数据用SPSS统计软件进行分析。2.结果与分析2. 1福建抗性小菜蛾的抗性测定由表1中可以看出，福建抗性小菜蛾相对于福建敏感的抗性倍数为180. 51倍，抗性水平较高。表1福建抗性小菜蛾种群同福建敏感小菜蛾种群对阿维菌素敏感性测定~SS~~LC50 (ug/ml)斜率b±SE 95%置信限卡平方值抗性倍数权利要求1.，步骤如下(1)随机捕捉5 15头待测种群的小菜蛾，分别制备每头小菜蛾的CDNA，即10个重复的待测样品；(2)制备小菜蛾敏感种群的cDNA，即阴性对照样品；(3)分别以待测样品、阴性对照样品为模板，进行荧光定量PCR反应；(4)统计计算比较待测样品与阴性对照样品的荧光定量PCR反应产物产量是否具有显著差异；其特征在于所述荧光定量PCR采用的引物如下 YG-S16 CGTCTACATCCGCATCTTCC, YG-A16CAAGATCGTCAGTCGTCCAA。2.根据权利要求1所述的方法，所述小菜蛾敏感本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．鉴定抗阿维菌素小菜蛾种群的方法，步骤如下：（１）随机捕捉５～１５头待测种群的小菜蛾，分别制备每头小菜蛾的ｃＤＮＡ，即１０个重复的待测样品；（２）制备小菜蛾敏感种群的ｃＤＮＡ，即阴性对照样品；（３）分别以待测样品、阴性对照样品为模板，进行荧光定量ＰＣＲ反应；（４）统计计算比较待测样品与阴性对照样品的荧光定量ＰＣＲ反应产物产量是否具有显著差异；其特征在于：所述荧光定量ＰＣＲ采用的引物如下：ＹＧ－Ｓ１６：ＣＧＴＣＴＡＣＡＴＣＣＧＣＡＴＣＴＴＣＣ，ＹＧ－Ａ１６ＣＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＧＴＣＧＴＣＣＡＡ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴青君，柳峰，梁延坡，孙礼兵，徐宝云，张友军，王少丽，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：11