一种苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法技术

本发明专利技术公开了一种苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法，该方法首先人工设计合成一对特异核苷酸序列作为引物，以引物对辣椒线粒体DNA进行PCR扩增，并对扩增产物以0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，若电泳结果中出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是不育型细胞质植株；若电泳结果中没有出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是可育型细胞质植株。其步骤简单快捷、稳定可靠，鉴别结果与田间花器官育性鉴定结果准确一致、重复性好，特别适用于辣椒CMS雄性不育分子标记辅助育种，能够很好地提高选择效率，加速育种进程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于辣椒育种领域，涉及一种植物分子标记方法，尤其涉及一种苗期鉴别 辣椒细胞质育性的分子标记辅助育种的方法。
技术介绍
辣椒是一种重要的常异花授粉蔬菜作物，杂种优势非常明显。目前我国辣椒杂交 种在生产上已占据主要地位，主要推广品种都是品种间或自交系间一代杂交种。这类杂交 种子在生产上虽然增产潜力很大，但其制种时必须人工去雄，费工费时，而且由于辣椒雌雄 同花同位，种子纯度很难保证，成本较高。辣椒雄性不育性状的利用，解决了杂种优势人工 制种去雄这一难题，降低了生产成本，成为杂交种选育的有效途径。辣椒雄性不育可分为细胞核雄性不育(GMS)和核质互作雄性不育(CMS)，其中利 用核质互作型辣椒雄性不育需要同时选育“三系”，包括雄性不育系，控制育性的基因型为 S (msms)，为不育型细胞质；保持系，控制育性的基因型为N (msms)，为可育型细胞质；恢复 系，控制育性的基因型为N (MsMs)或S (MsMs)。辣椒三系中不育系的不育性由核不育基因 和细胞质内的不育因子互作控制，属于核质雄性不育(CMS)。只有核不育基因与细胞质不育 因子共同存在时，才能引起雄性不育。这种类型的不育性既要筛选到保持系，又要找到恢复 系，才能可以实现三系配套。然而辣椒核质互作雄性不育系在生产上的应用受到很多不利 因素的限制。首先是育性恢复基因的分布不广泛，尤其在灯笼型辣椒类型中分布更少，配组 自由度很低，大大限制了其应用，是目前不育系应用的最大阻碍。其次是不育源较少，选育 周期长。这些已成为辣椒质核互作雄性不育性利用的瓶颈。开展辣椒生物技术的研究，使之与常规育种技术更紧密地结合。辣椒CMS雄性不 育系、保持系和恢复系的选育周期长，如果能找到与不育基因或恢复基因紧密连锁的标记， 必将有助于缩短这个过程。近年来发展起来的DNA分子标记具有量大、中性、可在任何时期 分析、不受植株生长发育环境条件的影响等优点，为利用分子标记辅助选择辣椒雄性不育 系和CMS恢复系提供了可能。
技术实现思路
针对上述
技术介绍
中存在的缺陷或不足，本专利技术的目的在于，提供一种苗期鉴别 辣椒细胞质育性的分子标记方法，该方法步骤简单快捷、稳定可靠，鉴别结果与田间花器官 育性鉴定结果准确一致、重复性好，特别适用于辣椒CMS雄性不育分子标记辅助育种，能够 很好地提高选择效率，加速育种进程。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案，其特征在于，该方法按以下步骤进行1)人工设计合成一对特异核苷酸序列作为引物，其中 正向弓丨物5，-CCCACACAAGACACATCACA-3，；反向引物5，-CGTACGAAATTCTTGGGCTTA-3，；2)提取辣椒线粒体DNA，以步骤1)的引物对辣椒线粒体DNA进行PCR扩增，并对扩增 产物以0. 8%的琼脂糖凝胶进行电泳；3)对电泳结果进行分析，若电泳结果中出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是 不育型细胞质植株；若电泳结果中没有出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是可育 型细胞质植株。上述PCR扩增的具体实现条件是(1)15μ L PCR 反应体系10 倍 PCR buffer 1.5 μ L、25 mmol Γ1 MgCl2 1.2 μ L、5 U · μ L-1Ta^ DNA 聚合酶 0· 12 μ L、5mmol · L-1 dNTPs 0. 3μ L.20 μ mol · L-1 正向弓|物 1· 0 μ L、20ymol · Γ1 反向引物 L 0μ L、40ng · μ L_1mtDNA 0. 5 μ L 以及 ddH20 9. 38 μ L ；(2)PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件是94°C预变性5min；94°C变性lmin，58°C 退火1 min，72°C延伸lmin，进行30个循环；最后72°C延伸IOmin ；于4°C保存备用。上述辣椒线粒体DNA采用高盐-蛋白酶K法提取。本专利技术的苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法，采用人工设计合成特异核苷 酸分子，以辣椒CMS雄性不育系、保持系线粒体DNA为模板扩增，创建和优化辣椒CMS雄性 不育性状可育型细胞质与不育型细胞质的分子标记技术体系，开发出与辣椒CMS细胞质育 性紧密连锁的分子标记，以期加快辣椒CMS雄性不育分子育种进程。这一方法用于辣椒 苗期细胞质育性筛选，能极大地加速辣椒CMS雄性不育亲本系的选育及杂种一代的育种进 程。附图说明图1是3个辣椒CMS雄性不育系及其3个保持系线粒体DNA PCR扩增产物0. 8 % 琼脂糖凝胶电泳分析示意图。图2是本专利技术所提供的第一实施例中6个辣椒品系线粒体DNA PCR扩增产物0. 8 %琼脂糖凝胶电泳分析示意图。图3是本专利技术所提供的第二实施例中6个辣椒品系线粒体DNA PCR扩增产物0. 8 %琼脂糖凝胶电泳分析示意图。以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步的详细说明。 具体实施例方式参见图1，图1是3个辣椒CMS雄性不育系及其3个保持系线粒体DNA经PCR扩增 后，其R扩增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳分析示意图，其中，图中的标记分别是M表示Biomed DM09-50 bp Ladder DNA Marker泳道；1表示不育系200A的扩增产物 泳道；2表示保持系200B的扩增产物泳道；3表示不育系201A的扩增产物泳道；4表示保持 系201B的扩增产物泳道；5表示不育系202A的扩增产物泳道；6表示保持系202B的扩增产 物泳道。专利技术人给出以下的实施例，这些实施例仅是用于理解本专利技术，本专利技术不限于这些 实施例。实施例1 1、人工设计合成一对特异核苷酸序列为引物，其中 正向引物5，-CCCACACAAGACACATCACA-3，反向引物5，-CGTACGAAATTCTTGGGCTTA-3，2、辣椒线粒体DNA的提取采用高盐-蛋白酶K法(刘光照等，辣椒不育系和保持系线 粒体差异基因获得及SNP分析，中国农业大学学报，2010，15 (5):19 24)分别提取6个 辣椒品系 T130、P65、GS102、PB3、B40、L33 的线粒体 DNA03、以步骤1的引物分别对上述6个辣椒品系线粒体DNA进行PCR扩增，扩增产物 经0. 8%琼脂糖凝胶电泳，参见图2，T130、GS102、L33的植株可出现长度为270bp的特异条 带，鉴别为不育型细胞质；而P65、PB3、B40的植株无此条带，鉴别为可育型细胞质；其中，M 是Biomed DM09-50 bp Ladder DNA Marker泳道；1是T130的扩增产物泳道；2是P65的扩 增产物泳道；3是GS102的扩增产物泳道；4是PB3的扩增产物泳道；5是B40的扩增产物泳 道；6是L33的扩增产物泳道。PCR扩增体系如下(1)15 μ L PCR 反应体系10 倍 PCR buffer :1. 5 μ L,25 mmol · L-1 MgCl2 1. 2μ L,5 U ‘ μ L-1Ta^ DNA 聚合酶 0. 12μ L,5 mmol .171 dNTPs 0. 3μ L,20ymol .Γ1 正向引物 1. 0 μ L， 20 μ mo 1 · Γ1 反向引物 1· 0μ L，mtDNA 0· 5μ L (40 ng · μ Γ1)本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法，其特征在于，该方法按以下步骤进行：１）人工设计合成一对特异核苷酸序列作为引物，其中：正向引物：５’－ＣＣＣＡＣＡＣＡＡＧＡＣＡＣＡＴＣＡＣＡ－３’；反向引物：５’－ＣＧＴＡＣＧＡＡＡＴＴＣＴＴＧＧＧＣＴＴＡ－３’；２）提取辣椒线粒体ＤＮＡ，以步骤１）的引物对辣椒线粒体ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，并对扩增产物以０．８％的琼脂糖凝胶进行电泳；３）对电泳结果进行分析，若电泳结果中出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是不育型细胞质植株；若电泳结果中没有出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是可育型细胞质植株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：巩振辉，黄炜，吉姣姣，逯明辉，陈儒钢，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：87