人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)原核表达和纯化的简便方法技术

本发明专利技术涉及人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)原核表达和纯化的简便方法。本方法通过人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)在原核细胞中的大量表达以及简便的纯化步骤，获得纯度高的目的蛋白。本发明专利技术所提供的工艺方案在工业生产中可满足生产周期短，生产成本低，蛋白产量高、产品品质高的总体要求。The?purity?of?recombinant?VEGF121(AZ-004).15％?SDS?page，0.86?ug?protein

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)原核表达和纯化的简便方法。
技术介绍
肿瘤的生长和存活依赖于生成的血管为它提供的氧气和营养物质。早在1971年， Folkman等就提出可阻断肿瘤血管的生成来抑制肿瘤的生长及转移。这就使人们对于肿瘤血管生成和成熟有关的血管生成因子进行了大量的研究。已有的研究已经发现与肿瘤血管生成有关的因子大约有30余种。其中，血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)能特异的促进细胞分裂、增殖及迁移，在肿瘤新生血管生成过程中起着至关重要的作用。VEGF 是一个家族，包括 VEGF-A、VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E 以及胎盘生长因子等；其中以对VEGF-A研究的最多。VEGF-A基因由8个外显子和7个内含子组成。经剪接后有5中不同单体，根据氨基酸的数目分别命名为VEGF121，VEGF145，VEGF165，VEGF189， VEGF206。VEGF-A能够促进血管内皮细胞增殖。目前，已经明确的能促进内皮细胞增殖的主要是VEGF121和VEGF165。另外，还能增加血管通透性和促进血管支持物的生成。VEGF-A 及其家族成员是近年来被认为在调节肿瘤血管生成中起重要作用的因子，临床治疗中的应用亦受到越来越多的关注。受体VEGFR-I是为造血干细胞的招募和单核细胞和巨噬细胞的迁移工作需要，受体VEGFR-2调节血管内皮功能，VEGFR-3调节淋巴管内皮细胞的功能。目前，国际上以VEGF 及其受体VEGFR为靶点治疗癌症是药物研究的热点；以期望克服当前癌症治疗药物普遍存在疗效不突出、易产生耐药性、副作用大的一些痼疾。目前国际上大部分的VEGF蛋白是由真核细胞表达来获得的，其蛋白产量低，且下游的纯化分离工作繁琐，极不适合大规模生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于实现一种人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)原核表达和纯化的简便方法。通过人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)在原核细胞中的大量表达以及简便的纯化步骤，获得纯度高的目的蛋白。本专利技术所提供的工艺方案在工业生产中可满足生产周期短，生产成本低，蛋白产量高、产品品质高的总体要求。本专利技术提供一种人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)原核表达和纯化的简便方法，其特征在于该方法通过如下步骤实现人来源的血管内皮生长因子121 (VEGF121) 原核表达和纯化(1)将PCR人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)基因连接到表达载体pET-28a ；(2)利用菌液来培养pET28a-VEGF121质粒，再经过IPTG诱导表达目的蛋白；(3)制备血管内皮生长因子121 (VEGF121)包涵体；(4)进行血管内皮生长因子121 (VEGF121)透析复性；(5)对血管内皮生长因子121 (VEGF121)进行亲和纯化；(6)通过凝胶过滤层析进一步纯化目的蛋白。所述血管内皮生长因子121(VEGF121)是从大肠杆菌高效表达的包涵体中进行制备纯化的。所述血管内皮生长因子121(VEGF121)的表达温度为37°C所述血管内皮生长因子121 (VEGF121)的纯化温度为室温或4°C。所述经过纯化的血管内皮生长因子121 (VEGF121)液氮冷激后于_80°C保存。本专利技术通过体外PCR扩增的方法，从人来源的血管内皮生长因子121的cDNA中扩增得到VEGF121基因，并通过NdeI和EcoRI限制性酶切位点与表达载体pET_28a连接；然后将质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3)获得高效表达。本专利技术由于在构建血管内皮生长因子121的表达载体时，表达载体pET_28a本身在5’端带有6个组氨酸标签的核苷酸序列，从而使表达的重组蛋白氨基酸序列的5’端也带有一个6个组氨酸标签。这使得后续纯化实验中可采用镍亲和层析的方法，一步就可以获得比较纯的蛋白(纯度>90%)，大大简化了纯化步骤，提高了蛋白的得率。本专利技术在设计PCR扩增时的上游引物时，人为地引入了一个烟草花叶病毒蛋白酶 (TEV蛋白酶)酶切位点ENLYFQG相应的核苷酸序列5，-GAGAACCTGTACTTCCAGGGA-3，。这个酶切位点的存在可以使烟草花叶病毒蛋白酶作用于该蛋白，切除重组蛋白氨基酸序列5’端带有的6个组氨酸标签，以获得天然结构的血管内皮生长因子121蛋白，从而满足不同用户的需要。具体实施例方式实施例1、血管内皮生长因子121 (VEGF121)的原核表达编码人来源的VEGF121基因通过NdeI和EcoRI限制性酶切位点与表达载体 pET-28a连接；然后将质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3)。挑取单克隆并接入含有3mL LB和终浓度为100 μ g/ml卡那霉素的培养基中，摇床 37°C，250rpm培养约16小时。将上述菌液按1 200的比例接入含有500mL LB和终浓度为100 μ g/ml卡那霉素的培养基中，摇床37°C，250rpm培养至OD6c 约为0.8，加入IPTG至终浓度为ImM，诱导4 小时之后收菌，离心，4000rpm，20min收集上清和沉淀。VEGF121诱导表达结果见附附图说明图1SDS-PAGE电泳检测蛋白的可溶性(电泳结果显示该蛋白为不可溶蛋白)，菌体于_80°C保存。VEGF121蛋白可溶性检测结果见附图22、血管内皮生长因子121 (VEGF121)包涵体的制备收集的菌体置于冰上融化，并按1 10(m/v)比例悬浮于Lysis buffer(50mM Tris ρΗ8· 0,300mM NaCl，10% glycerol)中，加入 Iysozyme 至终浓度为 lmg/mL，冰上孵育30min后，加入PMSF及DTT至终浓度分别为ImM和10mM。细胞经超声破碎仪裂解G50w，破碎 9. 9s，停 9. 9s，共 15 次)；离心 13000rpm,25min ；弃上清。包涵体用IB wash buffer (50mM Tris pH8. 0,300mM NaCl, 2% Triton X_100，5mM EDTA)洗涤3次，于-80°C保存。VEGF包涵体制备结果见图33、血管内皮生长因子121 (VEGF121)透析复性将上述获得的包涵体溶解于60mL denature buffer (50mM Tris pH8. 0,300mM NaCl,6Murea, 10% glycerol IOmM DTT)中，室温下MOrpm摇床培养lh。溶解后的包涵体离心13000rpm，25min，以去除不溶物。收集的上清用denature buffer稀释至浓度约为0. 1 lmg/mL，开始进行透析复性，所有的复性过程都在4°C下进行。在4L refolding buffer l(50mM Tris pH8. 0,300mM NaCl，2M urea,5 % glycerol,0. 5mM/5mM cystine/ cysteine)中过夜透析。第二天将透析液换成4L 的refolding buffer 2 (50mM Tris pH8. 0， 300mM NaCl, 1. 5Murea,5% glycerol,0. 5mM/5mM 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种人来源的血管内皮生长因子１２１（ＶＥＧＦ１２１）原核表达和纯化的简便方法，其特征在于该方法通过如下步骤实现人来源的血管内皮生长因子１２１（ＶＥＧＦ１２１）原核表达和纯化：（１）将ＰＣＲ人来源的血管内皮生长因子１２１（ＶＥＧＦ１２１）基因连接到表达载体ｐＥＴ－２８ａ；（２）利用菌液来培养ｐＥＴ２８ａ－ＶＥＧＦ１２１质粒，再经过ＩＰＴＧ诱导表达目的蛋白；（３）制备血管内皮生长因子１２１（ＶＥＧＦ１２１）包涵体；（４）进行血管内皮生长因子１２１（ＶＥＧＦ１２１）透析复性；（５）对血管内皮生长因子１２１（ＶＥＧＦ１２１）进行亲和纯化；（６）通过凝胶过滤层析进一步纯化目的蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：柴笑梅，朱月珍，杨宣武，吴咪佳，江永海，
申请(专利权)人：江苏普罗赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：32