本发明专利技术公开了一种高产腺苷的枯草芽孢菌，其分类命名为：枯草芽孢菌(Bacillus?subtilis)A409；其遗传标记为：鸟嘌呤营养缺陷型、黄苷酸氨化酶缺失，同时还具有8-氮黄嘌呤抗性；其保藏编号为CGMCC?No.4484，保藏日期为2010年12月17日。上述枯草芽孢杆菌菌株腺苷产量能够稳定在25g/L，比出发菌株的腺苷产量提高了5倍多，该菌株经过10代以上传代，生产腺苷的性能保持稳定，而且在5L发酵罐上也能够维持较高水平，具有大规模工业化的潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物
，涉及一种高产腺苷的枯草芽孢杆菌。
技术介绍
腺苷(Adenosine)又称腺嘌呤核苷，是人体细胞中具有重要生理功能的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸而参与心肌的能量代谢，具有抗癫痫和强效扩张冠脉的作用，临床上于治疗冠状血管障碍、心肌梗塞、动脉硬化、中风后遗症、原发性高血压、心绞痛等。同时腺苷还是重要的医药中间体，可合成8-氯腺苷、嘌呤毒素、高瓜氨基腺苷、赖氨酰氨基腺苷、S-甲硫腺苷、阿糖腺苷、环磷酸腺苷、三磷酸腺苷等。因此，腺苷具有广阔的市场和开发前景。目前，腺苷的生产方法有化学合成法、酶解法和发酵法三种。化学合成法主要是以次黄嘌呤、肌苷、2-甲基硫代腺苷、2，8_二氯嘌呤、2' ,3' ,5'-三乙酰基次黄苷等为起始原料，经过多步反应合成的。此方法溶剂损耗量大，收率低，成本高，产量小，且环境污染严重。酶解法就是用酶将RNA降解得到的腺苷，但是RNA降解过程产生4种核苷的混合物，给提取分离带来很大困难，也增加了成本。腺苷发酵生产工艺技术首推日本，早在70年代就开始了该领域的研究，取得了一系列成果，迄今已进入大规模工业生产阶段。1968年Konishi等使用枯草杆菌的异亮氨酸缺陷型(lie-)，在异亮氨酸0.03%的培养基中可以累积腺苷U66g/L。1971年Haneda 等人由枯草杆菌诱变一株肌苷产生菌Bacillus sp. No. 1043，用MNNG(N-甲基-N'-硝基-N'-亚硝基胍)处理，得到缺失AMP脱氨酶的黄嘌呤缺陷型腺苷产生菌P53-18突变株，可以积累腺苷达16g/L。国内发酵生产腺苷起步较晚，但发展较快。高淑红(工业微生物，2008,38 ) 42-46)等使用 Bacillus sp. ATCC 21616，最终积累腺苷 10. 37g/L，柏建新 (CN1657608A)等从肌苷菌株出发选育出B. subtilis CGMCC No. 1304，最高可积累腺苷达 23g/L，但是易产生回复突变，产量不稳定。离子注入技术作为一种新颖、有效的生物品种改良新技术已在工业微生物育种、 农作物诱变育种、植物转基因、生命起源以及环境辐射与人类健康等方面取得了一系列重要研究成果。与传统诱变源相比，离子注入除了具有能量沉积效应外，还具有动量传递、质量沉积及电荷中和与交换效应，是一种将物理诱变和化学诱变特性相结合的综合诱变方法，能够在低剂量注入、细胞损伤较轻的情况下，强烈地影响生物细胞的生理、生化性能，造成碱基的改变，诱发染色体结构变异(余增亮，物理，1997，沈(6) :333-338)，产生比其它电离辐射更为丰富的生物学内容和更为广泛的诱变图谱。因此，离子注入进行工业微生物育种已成为研究热点，并取得了丰硕成果。虞龙(Acta Laser Biology Sinica，1999，8 (3) 17-220)等用离子注入诱变筛选到一株遗传性能稳定的高产菌，使维生素C在300t发酵罐上糖-酸摩尔转化率达到94. 8 %，重量转化率为102%，被业内专家喻为“自维生素C 二步法发酵专利技术以来的重大突破”。陈祖华(微生物学通报，2000，27 (3) :174-177)等用离子注入诱变处理热带假丝酵母，经筛选，获得了 1株能够利用正十二烷烃发酵产生长链二元酸的高产菌，在底物浓度为15% (体积比)下产酸量由43. 5% g/L上升到73. 2% g/L。惠友权(西北大学学报，2001，31 (3) =251-254)等应用离子注入对产黄嘌呤氧化酶的球形节杆菌进行离子诱变筛选，得到较出发菌株提高40%的突变菌株。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种高产腺苷的枯草芽孢菌，以克服腺苷产量不高、传代不稳定、易出现回复突变的问题。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下一种高产腺苷的枯草芽孢菌，其分类命名为枯草芽孢菌(Bacillus subtilis) A409 ；其遗传标记为鸟嘌呤营养缺陷型、黄苷酸氨化酶缺失，同时还具有8-氮黄嘌呤抗性；目前该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)， 保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为 100101，其保藏编号为CGMCC No. 4484，保藏日期为2010年12月17日。该菌株是通过对一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 301 (腺苷产量低，而传代不稳定，极易产生恢复突变)进行低能离子束注入，然后将诱变后的菌株转接于完全培养基平板上培养，采用双平板技术和抗性平板技术筛到腺苷高产菌。枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 301是本实验室自行从土壤中筛选得到的菌株。本专利技术采用离子束照射技术进行菌体诱变，具体诱变过程如下菌体经斜面培养基活化培养后，用磷酸缓冲盐洗下新鲜菌落，振荡，使其充分分散，制成一定浓度的悬浊液，备用。取0. Iml菌悬液均勻涂布于灭过菌的平皿中，以无菌风吹至干燥后进行离子注入。离子注入机为LZD900多功能离子注入机。使用20KeVN+离子在不同剂量进行注入，靶室真空度为10-31^。将平皿置于靶台上，以k脉冲式注入，间隔 15s，然后取出平皿，以Iml无菌水洗脱，涂布于完全培养基平板上，于30°C培养7 用于单菌落的挑选。本专利技术的鸟嘌呤缺陷型、黄苷酸氨化酶缺失菌株分离筛选方法为双平板技术，具体操作方法为挑出完全培养基平板上圈大饱满的菌落，对应点在基本培养基、鸟嘌呤补充培养基平板上，挑选在基本培养基上不生长，而在含鸟嘌呤的补充培养基上生长的相对应位置菌落。将检出的菌株转接于斜面，用于营养缺陷型的鉴定，以及进行发酵培养，从而筛选出产腺苷高的菌株。本专利技术的抗8-氮黄嘌呤菌株的分离筛选方法为用离子束照射上面筛选出的菌株的菌悬液，经适当稀释后涂布于8-氮黄嘌呤抗性培养基平板上，320C培养48小时挑取生长良好的菌落转接于斜面，进行发酵培养，最终筛选到腺苷高产菌。本专利技术中的培养基配制为斜面培养基(g/L)葡萄糖10-30，蛋白胨10-20，酵母膏10-20，玉米浆10-20， NaCl 3-5，琼月旨 20，pH 6. 4-7. 5。基本培养基(g/L)葡萄糖3-8，(NH4)2SO4 1-5，柠檬酸钠 0. 5-2. 5，KH2PO4 5-10,Κ2ΗΡ04 · 3H20 2-5，MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5，FeSO4 · 7H20 0. 01-0. 05，MnSO4 · H2O 0. 01-0. 05， 琼脂 20，pH 6. 4-7. 5。完全培养基(g/L)葡萄糖5，蛋白胨10，酵母膏5，牛肉膏10，NaCl 3，琼脂20，pH 6. 4-7. 5。鸟嘌呤补充培养基(g/L)基本培养基+鸟嘌呤0. 1-0. 5，pH 6. 4-7. 5。抗性培养基(g/L)葡萄糖3-8，(NH4)2SO4 1_5，柠檬酸钠 0. 5-2. 5，KH2PO4 5-10, Κ2ΗΡ04 · 3H20 2-5，MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5，FeSO4 · 7H20 0. 01-0. 05，MnSO4 · H2O 0. 01-0. 05， 鸟嘌呤0. 1-0. 5，不同本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种高产腺苷的枯草芽孢菌，其分类命名为：枯草芽孢菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ａ４０９；其遗传标记为：鸟嘌呤营养缺陷型、黄苷酸氨化酶缺失，同时还具有８－氮黄嘌呤抗性；其保藏编号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４４８４，保藏日期为２０１０年１２月１７日。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，曹家明，柏建新，陈晓春，任华景，陈勇，熊健，吴菁岚，谢婧婧，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：84
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