抗ＮＯＧＯ－６６受体（ＮＧＲ）的中和单克隆抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及结合Ｎｏｇｏ－６６的分离的蛋白，尤其是单克隆抗体。具体来说，这些抗体具有抑制Ｎｏｇｏ－６６受体的天然配体的结合及中和Ｎｏｇｏ－６６受体的能力。本发明专利技术的这些抗体或其部分可用于例如在患有疾病的人中检测ＮｇＲ及抑制ＮｇＲ活性，其中ＮｇＲ或Ｎｏｇｏ－６６活性在所述疾病中是有害的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗NOGO-66受体(NGR)的中和单克隆抗体及其用途本申请要求享有2006年11月21日提交的临时申请序列号60/860,256的优先权。
本申请描述了Nogo-66受体结合蛋白，尤其是单克隆抗体，其能够结合Nogo-66受体并中和Nogo-66受体的功能。因此这些抗体可用于治疗数种疾病，包括但不限于哺乳动物脑外伤、脊髓损伤、中风、神经变性疾病和精神分裂症。背景信息损伤后哺乳动物中枢神经系统(CNS)内的轴突再生通常是不可能的；其结果取决于CNS内神经纤维再生的固有能力与CNS内抑制因子的平衡，所述抑制因子集中在损伤部位的微环境中，主动防止再生从而阻止受损纤维束的再生。已经证明由少突胶质细胞产生的CNS髓磷脂通过在体外及体内引起生长锥萎缩，是损伤早期轴突生长最相关的抑制(non-permissive)因子，其导致轴突生长的直接抑制(综述参见：Lee等人，2003)。直到最近才鉴定出CNS髓磷脂的主要抑制因子：少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)，髓磷脂相关糖蛋白(MAG)和Nogo-A(Domeniconi等人，2002；综述：Woolf&Bloechinger，2002；McGee&Strittmatter，2003；Lee等人，2003)。后一蛋白包含结构域Nogo-66(GrandPré等人，2000)，其行使主要抑制功能。有趣地是，所有3种抑制蛋白在CNS中都显示高表达水平，并与相同的神经元糖基化磷脂酰肌醇(GPI)部分锚定的受体(Nogo-66受体或NgR)相互作用(Fournier等人，2001)。Nogo-66受体(NgR)是473个氨基酸的糖基化磷脂酰肌醇连接蛋白。它由N末端信号序列，然后是8亮氨酸富集重复结构域、亮氨酸富集重复C端结构域(共同形成所谓的胞外域)和GPI锚定结构域组成。通过GPI锚，NgR与外部神经元质膜连接。NgR自身属于3种CNS富集的GPI锚定蛋白(被称为NgR、NgR2和NgR3)的家族，具有约40％的序列同一性，但就整体结构组织来说非常类似(Barton等人2003；Lauren等人2003；Pignot等人2003)。尽管NgR是已知的唯一与多种髓磷脂相关抑制分子相互作用的成员，但最近显示MAG也与NgR2相互作用(Venkatesh等人2005)。NgR同系物的功能目前是未知的。NgR自身在啮齿类动物或小鸡发育的早期不表达，但在成年动物中显示高表达水平；NgR在大部分(如果不是全部)CNS区域中表达，包括脊髓(Hunt等人，2002a，b)。已经证明小鸡(Fournier等人，2001)、大鼠(Hunt等人，2002a)和小鼠(Wang等人，2002b)中mRNA和蛋白水平的脊髓表达。在成年CNS组织内，NgR蛋白在所有成熟的神经元(包括它们的轴突末梢)中表达。配体结合NgR起始胞内信号级联反应，其导致轴突生长抑制和生长锥萎缩。因为NgR不包含跨膜结构域，信号转导需要将NgR/配体相互作用信号转导入细胞的共受体。NgR信号转导的起始步骤是其与共受体p75或TROY的相互作用(Wong等人，2002；Shao等人，2005；Park等人，2005)。已经鉴定出第二共受体，被称为Lingo-1。只有NgR、P75或TROY与Lingo-1的三元复合物构成的才是功能性信号复合物(Mi等人，2004；Park等人，2005)。该信号转导的结果是肌动蛋白细胞骨架的重排。在神经元中，这种肌动蛋白细胞骨架的变化引起轴突生长的抑制及生长锥萎缩的诱导。体外，来自NgR(-/-)小鼠的背根神经节细胞与Nogo66的结合能力较低，在生长锥萎缩分析中对Nogo66、Fc-MAG、OMgp或髓磷脂的抑制作用反应较弱(Kim等人，2004)。在部分或完全的脊髓损伤后，NgR(-/-)小鼠显示脑干束(brainstemtracts)再生的增加，所述脑干束包括红核脊髓束和中缝脊髓束(raphespinaltracts)。甚至在脊髓的完全实验性横切后，NgR(-/-)小鼠在旷场试验中显示增强的功能恢复。在脊髓的半切除及完全横切后，NgR(-/-)小鼠中的恢复显著好于纯合的(+/+)和杂合的同窝小鼠(Kim等人，2004)。本申请描述了抗NgR的中和单克隆抗体的制备，该抗体选择性的竞争Nogo-66结合，并且被预期改善一些病症，在所述病症中NgR活性可能是有害的。本专利技术的中和单克隆抗体被预期例如促进受损CNS的神经元再生，尤其是在急性脊髓损伤、脑外伤或神经变性疾病(诸如，亨廷顿氏舞蹈病，帕金森氏病，阿尔茨海默氏病或多发性硬化)之后。附图简述图1a和1b：抗体mAb50和mAb51结合人和大鼠NgR。图2：mAb50和mAb51与AP-Nogo66结合NgR-Fc的竞争。图3：mAB50和mAB51与Nogo66结合HEK293f细胞上表达的人和大鼠NgR的竞争。图4：mAB50和mAB51与NTera2细胞的结合。图5：NTera2细胞团块中轴突生长的定量。图6：hNgR的缺失突变体。图7：MAG-Fc结合NgR-Fc的竞争。图8：许可和抑制条件下的大鼠背根神经节神经元，及mAb50对Nogo66诱导的轴突生长抑制的中和。图9：大鼠DRG细胞中mAB50和mAb51对Nogo66诱导的轴突生长抑制的中和。序列表SEQIDNO.1A：人NGR蛋白SEQIDNO.1b：人NgR核苷酸SEQIDNO.2a：大鼠NgR蛋白SEQIDNO.2b：大鼠NgR核苷酸SEQIDNO.3：抗体克隆50VHSEQIDNO.4：抗体克隆50VLSEQIDNO.5：抗体克隆51VHSEQIDNO.6：抗体克隆51VLSEQIDNO.7a：AP-NOGO-66蛋白SEQIDNO.7b：AP-Nogo-66核苷酸专利技术详述本申请涉及与Nogo受体(NgR)相互作用的分离的结合蛋白，尤其是结合并中和人及大鼠NgR的中和单克隆抗体。这些抗体能够与Nogo-66竞争结合NgR。本申请的其他方面包括利用上述结合蛋白制备药物组合物的方法，及使用这种结合蛋白的方法。抗体本申请的主要实施方案包括分离的蛋白或多肽，它们特异性结合Nogo-66受体(NgR)的至少一个表位。术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是根据其起源或衍生来源与其天然状态伴随的天然结合组分不结合的蛋白多肽；基本上不含相同物种的其他蛋白；由不同物种的细胞表达；或在自然界不存在。因此，化学合成的或在不同于其天然来源的细胞的细胞系统中合成的多肽将从其天然结合组分“分离”。利用本领域公知的蛋白纯化技术通过分离也可以使蛋白基本上不含天然的结合组分。本文使用的术语“多肽”是指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白”与术语多肽可以互换使用，也表示氨基酸的聚合链。术语“多肽”包括天然或人工蛋白，蛋白片段及蛋白序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。特异性结合Nogo-66受体(NgR)的至少一个表位的分离的蛋白或多肽能够抑制配体与所述NgR的结合。Nogo-66受体(NgR)是473个氨基酸的糖基化磷脂酰肌醇连接蛋白。它由N末端信号序列，然后是8亮氨酸富集重复结构域、亮氨酸富集重复C端结构域(共同形成所谓的胞外域)和GPI锚定结构域组成。通过G本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的结合蛋白，其与Ｎｏｇｏ－６６受体的至少一个表位特异性相互作用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2006-11-21 60/860,2561.一种单克隆中和抗体或其抗原结合片段，其与Nogo-66受体的至少一个表位特异性相互作用，其中所述单克隆中和抗体或其抗原结合片段包含：包括包含SEQIDNO：3的序列的重链可变区(VH区)的序列；和包括包含SEQIDNO：4的序列的轻链可变区(VL区)的序列。2.权利要求1的中和抗体，其中所述中和抗体降低Nogo-66与受体结合的能力。3.权利要求1的中和抗体，其中所述中和抗体能够中和Nogo-66受体。4.权利要求1的抗体，其中所述Nogo-66受体选自人，短尾猴，大鼠，小鸡，蛙和鱼。5.权利要求1的抗体，其中所述Nogo-66受体的多肽序列与选自SEQIDNO：1a和SEQIDNO：2a的氨基酸序列具有90％同源性。6.权利要求1的抗体，其中所述Nogo-66受体由与核酸序列SEQIDNO：1b和SEQIDNO：2b具有90％同源性的核酸编码。7.权利要求1的抗体，其具有范围从10-7M到10-13M的解离常数(Kd)。8.权利要求1的抗体，其具有范围从103M-1s-1到107M-1s-1的结合速率常数(Kon)。9.权利要求1的抗体，其具有范围从10-3s-1到至少10-6s-1的解离速率常数(Koff)。10.权利要求1的抗体，其具有范围从10-6s-1到至少10-12s-1的IC50值。11.权利要求1的抗体，其结合人NgR的EC50范围为1×10-9M到1×10-11M。12.权利要求1的抗体，其结合人NgR，其中所述抗体是糖基化的。13.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是小鼠抗体，人源化抗体，完全人的抗体，嵌合抗体，人源化抗体的抗原结合片段，或嵌合抗体的抗原结合片段。14.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是选自Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段和Fv片段的抗原结合片段。15.一种单克隆抗体，其特异性结合Nogo-66受体的至少一个表位，其中所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞系ATCCNO.PTA-8383分泌的单克隆抗体。16.权利要求15的单克隆抗体，其中所述结合导致Nogo-66受体的失活。17.一种产生权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞系，所述单克隆抗体特异性结合Nogo-66受体的至少一个表位。18.权利要求17的杂交瘤细胞系，其中所述杂交瘤选自小鼠和人杂交瘤。19.权利要求17的杂交瘤细胞系，其中所述杂交瘤选自大鼠，绵羊，猪，牛，山羊和马杂交瘤。20.权利要求1的单克隆中和抗体或其抗原结合片段，具有选自以下的至少一个特征：a)以nM范围或更低的亲...

【专利技术属性】
技术研发人员：M梅茨勒，A梅勒，R米勒，BK米勒，T加于尔，EH巴罗，M施米德特，A梅耶，N托伊施，
申请(专利权)人：雅培制药有限公司，艾博特股份有限两合公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]