以5‑烯醇式丙酮酰莽草酸‑3‑磷酸合酶基因为靶的改造锌指蛋白制造技术

现行公开涉及在植物中以5‑烯醇式丙酮酰莽草酸‑3‑磷酸合酶(EPSPS)基因为靶的改造锌指蛋白，以及使用上述锌指蛋白调整基因表达，基因失活与靶向基因修饰的方法。具体而言，本公开涉及供靶向剪切与改变EPSPS基因的锌指核酸酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术主要涉及植物中基因组工程，基因打靶，靶向染色体整合及蛋白质表达等 领域。特别而言，本专利技术涉及以5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase)基因为革巴的改造锌才旨蛋白(engineered zinc finger proteins)，及在调节基因表达、基因失活及靶向基因修饰中使用该锌指蛋白的方法。更加 特别而言，本专利技术属于催化EPSPS基因靶向剪切和改变的改造锌指核酸酶。现有技术农业中一个主要让人感兴趣的方向，尤其考虑到不少植物基因组全核苷酸序列业 已确定，是靶向调节基因表达和基因序列改变。特别而言，调节基因表达及修饰内源植物序 列的能力可以促进许多应用，例如，农作物特性的优化，所述特性影响营养价值、产量、胁迫 耐受性、病原体抗性、油质量以及对农药的抗性和/或改造植物用作生物工厂以生产医药 化合物或工业化学品。改造锌指蛋白(ZFPs)已被方便的用于选择性的调节基因表达及靶向改变植物 基因序列(参见，如，u. S. Patents Nos. 7，262，054，7，235，354，7，220，719，7，001，768 与 6，534，261 ；以及U.S. Serial No. 60/874，911)。锌指蛋白是以序列特异性为特征依靠 称为锌指由金属稳定化的域结合DNA、RNA和/或蛋白质的蛋白质。参见，例如，Miller 等人(1985) EMBO J. 4 1609-1614 ；Rhodes et al. (1993) Sci. Amer. 268(2) :56_65 ；及 Klug(1999)J. Mol.Biol. 293 :215_218。ZFPs通常见于转录因子，迄今为止，在数千已知或 推定的转录因子中辨识出超过10000个锌指序列。对所选基因靶的调节和改变理论上可以通过设计对具有所希望生物活性，预先确 定的DNA序列有特异性的ZFPs来达成。例如，将锌指结构域与调节性的域在融合蛋白中结 合，从而产生改造锌指转录因子以控制基因调节(参见，例如U. S. Patent No. 6，534，261)。 锌指结构域亦与核酸酶剪切域结合，产生锌指核酸酶(ZFNs)以特异性的靶向希望修饰 (如，缺失，突变，同源重组或插入外源序列)的基因组双链断裂(参见，如U.S. Patent ApplicationPublication Nos. 2007/0134796 与 2005/0064474)。改造 ZFPs 极大的促进了 外源序列的插入或在植物中特异靶位点内源序列的修饰，并提供了比常规方法效率更高的 对植物基因组的靶向改变(参见，如 U. S. Patents Nos. 7，262，054，7，235，354，7，220，719， 7，001，768 与 6，534，261)。然而，基因组复制常见于植物中，而且仍有对在植物基因组中靶向改变上述共生 同源基因(paralogous genes)，以及在植物中调节共生同源基因表达的组合物与方法的需 求。专利技术概述本专利技术提供在植物细胞中调节表达及靶向改变一个或多个共生同源基因(例如 EPSPS基因)的组合物与方法。植物细胞可以来自单子叶植物(monocots)或双子叶植物(dicots)物种，亦包括培养的细胞，在任何发育阶段植物中的细胞，以及从全本植物上移除 的细胞和置回植物的细胞(或其后代)。植物细胞亦包括一个或多个同源或共生同源的基 因序列，其中任何部分或全部可作为本专利技术描述方法进行修饰的靶。在一方面，本文描述结合作为目标EPSPS靶基因组区域的锌指蛋白(ZFPs)，其中 所述ZFP包括一个或更多改造的锌指结合区域。在一些实施方案中，锌指结合区域包含表 A所示的序列。在一些实施方案中，作为ZFP靶的EPSPS基因包括选自下组的核苷酸序列 SEQ ID NOS 10-14或与其至少有大约80% -100 %同一性的序列，包括任何在该范围内的 同一性百分比，例如与其有 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99%序列相同(序列同一性)。在一些实施方案中，所述ZFP是融合蛋白，包含一个或更多 的调节区。在一个实施方案中，一个或更多的调节区选自下组转录阻抑物、核酸内切酶、甲 基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、转录激活物以及组蛋白乙酰转移酶。在一个实施方案中，所述 ZFP与EPSPS基因的靶序列结合，其中EPSPS表达增加或降低。在一个实施方案中，所述ZFP 与EPSPS基因的转录调节序列结合。在另一个实施方案中，所述ZFP在EPSPS基因的转录 起始位点上游结合。在另一个实施方案中，所述ZFP在EPSPS基因转录起始位点邻近结合。 在另一个实施方案中，所述ZFP在EPSPS基因的转录起始位点下游结合。在一个实施方案 中，所述ZFP在EPSPS基因转录起始位点下游的RNA多聚酶暂停位点(pause site)邻近结口 O在一个实施方案中，所述ZFP是剪切目标EPSPS靶基因组区域的锌指核酸酶 (ZFN)，其中所述ZFN包含一个或更多改造的锌指结合区域，与核酸酶剪切(cleavage)域。 在一些实施方案中，所述ZFN包括融合多肽，所述多肽包含对EPSPS基因序列有特异性的改 造的锌指结合区域与剪切域，所述ZFN还包括一个或更多融合多肽，所述多肽包含改造的 锌指结合区域与剪切半域(half domain)。在一些实施方案中，锌指结合区域包括选自由包 含表A所示识别域的锌指蛋白组成的组。剪切域与剪切半域可由例如各种限制性核酸内切 酶和/或靶向(homing)核酸内切酶得到。在一个实施方案中，所述剪切域与剪切半域源自 IIS型限制性核酸内切酶(例如，Fok I)。所述ZFN可能特异性的剪切一种特定EPSPS基 因序列。或者，所述ZFN可能剪切两种或更多同源EPSPS基因序列，所述同源序列可能包括 EPSPS共生同源或正向(orthologous)同源基因序列。在一些实施方案中，作为ZFN靶的EPSPS基因包含选自下组的核苷酸序列SEQ ID NOS 10-14或与其至少有大约80% -100%同一性的序列，包括任何在该范围内的同一性百 分比，例如与其有 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%序列同一性。所述ZFN可能在EPSPS基因的编码区域内或在该基因内或邻近该基因的非编码区 域，例如，前导序列、尾随序列或内含子，或者在非转录区域内编码区域上游，或其下游区域 结合和/或剪切EPSPS基因。在一些实施方案中，所述ZFN结合和/或剪切所述EPSPS基 因的编码序列或调节序列。在一些实施方案中，所述ZFN在选自由SEQ ID N0S:10-14的核 苷酸序列组成的区域内结合并剪切EPSPS基因。在另一方面，本文描述了包括一个或更多ZFP的组合物，所述组合物可能包含一 个或更多ZFN。植物细胞可能包含一个独特的EPSPS基因或多个EPSPS共生同源基因。因 此，组合物可能包括一个或更多ZFP，所述ZFP在植物细胞中靶向一个或更本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非天然存在的锌指蛋白（ＺＦＰ），其结合于目标ＥＰＳＰＳ靶基因组区域，所述ＺＦＰ包括一个或多个改造的锌指结合区域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-9-27 60/995,557一种非天然存在的锌指蛋白(ZFP)，其结合于目标EPSPS靶基因组区域，所述ZFP包括一个或多个改造的锌指结合区域。2.权利要求1所述的ZFP，其中所述ZFP为包含一个或多个功能域的融合蛋白。3.权利要求2所述的ZFP，其中一个或多个功能域选自下述组成的组转录阻抑物、核 酸内切酶、甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、转录激活物和组蛋白乙酰转移酶。4.权利要求3所述的ZFP，其中所述ZFP为下述的锌指核酸酶(ZFN)，其剪切目标EPSPS 靶基因组区域，所述ZFN包含一个或多个改造的锌指结合区域与核酸酶剪切域。5.权利要求4所述的ZFN，其中所述ZFN剪切一个或多个EPSPS共生同源基因或直向 同源基因序列。6.编码权利要求1-5中任一所述的一个或多个锌指蛋白(ZFP)的多核苷酸。7.包含权利要求6所述的一个或多个多核苷酸的植物宿主细胞。8.权利要求7所述的植物宿主细胞，其中所述细胞以一个或多个多核苷酸稳定转染。9.权利要求7所述的植物宿主细胞，其中所述细胞以一个或多个多核苷酸暂时转染。10.一种在植物细胞中剪切一个或多个EPSPS基因的方法，所述方法包括下述步骤将权利要求6所述的一个或多个多核苷酸导入植物细胞；和在所述细胞中表达所述一个或多个ZFN，其中所述ZFN剪切一个或多个EPSPS基因。11.权利要求10所述的方法，其中至少一个多核苷酸稳定转染入所述植物细胞中。12.权利要求10所述的方法，其中至少一个多核苷酸暂时转染入所述植物细胞中。13.权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述植物细胞中所有的EPSPS共生同源 基因被剪切。14.权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述植物细胞中一个或多个EPSPS共生 同源基因被剪切。15.包含第一和第二DNA序列的供体载体；其中所述第一序列和第三序列同源，而所述第二序列与第四序列同源；且其中所述第三与第四序列为染色体EPSPS DNA序列。16.权利要求15所述的供体载体，其中第三与第四序列的近边(nearedge)为毗连的。17.权利要求15所述的供体载体，其中第三与第四序列的近边通过至少一个核苷酸对 分隔。18.权利要求15-17中任一项所述的载体，其中所述第三与第四序列为外源序列。19.权利要求15-17中任一项所述的载体，其中所述第三与第四序列为内源序列。20.权利要求15-19中任一项所述的载体，进一步包含第五序列，其中所述第五序列(a)插入所述第一与第二序列间；且(b)为外源核酸序列。21.权利要求20所述的载体，其中所述第五序列包含编码选择性标记的序列。22.权利要求21所述的载体，其中选择性标记选自下述组成的组绿色荧光蛋白 (GFP)、0 -葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、草胺膦N-乙酰转移酶(PAT，BAR)、新霉素磷酸转移酶、 潮霉素磷酸转移酶、内酰胺酶、儿茶酚二氧合酶、a-淀粉酶、酪氨酸酶、半乳糖苷 酶、荧光素酶、水母发光蛋白、EPSP合酶、腈水解酶、乙酰乳糖合酶(ALS)、二氢叶酸还原酶 (DHFR)、茅草枯脱卤素酶及邻氨基苯甲酸合酶。23.权利要求20所述的载体，其中所述第五序列包含选自下组的序列编码除选择性 标记以外蛋白质的序列；一个或多个转录调节序列；一个或多个增强或减弱蛋白质靶向的 序列；一个或多个编码蛋白质的部分的序列；小干扰RNA ；和微RNA。24.权利要求23所述的载体，其中所述第五序列包含编码突变体EPSPS染色体序列的 序列，其增加植物针对除草剂草甘膦的耐受性。25.一种将外源核酸序列导入植物细胞基...

【专利技术属性】
技术研发人员：曼朱格普塔，阿莎M帕尔塔，斯蒂芬诺瓦克，菲奥多厄诺夫，桑尼塔戈帕兰，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，桑格摩生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]