本发明专利技术涉及玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特异SSR标记及其应用，属于植物育种技术领域。玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的特异SSR标记（PC9）正向引物为（5′-3′）ATTCCTCCAAACGAGCCCTA，反向引物为（5′-3′）CTGGTAAATGACGATTCCGC。所述应用方法包括：1）提取水稻、玉米基因组DNA和/或RNA或cDNA；2）使用所述正反引物序列PCR扩增转玉米PEPC基因水稻、玉米基因组DNA和/或RNA或cDNA；3）电泳检测扩增产物。本发明专利技术通过该标记辅助选择，可以准确地将任意玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因转育到水稻品种中去，极大地提高转所有玉米PEPC基因水稻的选育效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特异SSR标记及其应用，属于植 物育种
技术介绍
C4植物具有光呼吸低、氮素和水分利用效率高、光能利用效率高的优点，C4光合相 关酶在对生物和非生物逆境（如机械创伤、低温、盐害及紫外辐射等）的防御反应中也有较 重要的作用。由于主要粮食作物如水稻、小麦等C3植物不具有这些优势，人们就希望将C4 这些优势特征引入水稻等c3作物中。PEPCase是C4途径的关键酶，国内外对该基因的研究 报道也比较多，已有不少将玉米PEPC基因成功转入水稻中的报道（Hudspeth等，1992;Ku 等，1999 ;焦德茂等，2001 ;李霞等，2001 ;王德正等，2002 ;何立斌等，2006 ;袁定阳等，2007 ; 向珣朝等，2009;周宝元等，2011;李万昌等，2014)。这些转基因水稻的0)2补偿点和光呼吸 速率显著降低，表观净光合速率提高，产量也有不同程度的提高。为了加快转玉米PEPC基因水稻的选育进程，利用分子标记进行辅助选择是一种 比较快速、适用的技术。很多研究开发了玉米PEPC基因分子标记并进行基因检测（刘峰等， 2005 ;何立斌等，2006 ;高东迎等，2006 ;袁定阳等，2007 ;丁在松等，2007 ;张边江等，2008 ; 张彬等，2009;李艳等，2009;张庆琛等，2010;张建红等，2012;杜西河等，2013)，但这些分 子标记的碱基序列要么位于非编码区，要么跨叠非编码区，不利于基因表达分析（转基因 的重要目的之一就是希望目的基因能正常表达）；而且这些标记在不同玉米品种（系）之 间或者不同水稻品种之间存在着差异，不能快速、简单、高效地区分所有玉米PEPC基因与 水稻PEPC基因的差异。由于PEPC基因广泛存在于各种植物中，如玉米、高粱、稗草、栽培 稻、短花药野生稻、大麦、普通小麦、狗尾草、弓果黍、芦苇、二穗短柄草、松叶菊属、羽毛针禾 等植物，但现在转C4-PEPC基因的研究主要集中在转不同玉米的PEPC基因上，且截止目前 还未见只针对玉米PEPC基因筛选通用分子标记的报道。本研究以经典玉米品系B73的 PEPC(NC_024463)基因为例进行开发玉米特异SSR标记的探索。该玉米PEPC基因包含10 个外显子和9个内含子，首先将10个外显子序列逐一在NCBI数据库进行比对，发现这10 个外显子不但在不同物种（如玉米、水稻、小麦、高粱、大麦、稗草等）之间存在着明显的差 异，而且在不同玉米品种（系）之间都存在着一定差异，即使一些片段比较长的外显子（如 第2、4、8、9和10外显子）和片段大小一般的外显子（如第1和5外显子）在不同玉米品 种（系）上也存在着很多差异位点，如缺失、插入、错配（相对于B73的碱基序列而言），导 致这些位置无法进行玉米特异SSR标记的设计；第3外显子（936-1020,85bp)和第6外显 子（2960-3047,88bp)不但片段比较小（不适于SSR标记的设计），而且在不同玉米品系上 也存在着差异；最初比对第7外显子（4717-4871，155bp)时发现黍族的Zuloagaeabulbosa 植物与该玉米在碱基序列一致，但仔细分析发现它在已知的玉米品种PEPC基因序列里面 至少有152bp(除与玉米品系Z561前3个碱基aat没有比对上外，截止2015年6月22日 的NCBI数据）的序列是完全一致的，然而该外显子在NCBI数据库水稻基因组中也没有发 现较为接近的比对结果。我们试着对该外显子进行SSR引物设计，然后选择不同玉米和水 稻品种进行PCR扩增，结果意外地发现该引物（命名为PC9)在所有玉米材料中都能扩增出 预期长度为131bp的片段（图1)，而在所有不同水稻品种中则能扩增出大约340bp的片段 (图2)，通过该引物完全可以区分水稻与玉米PEPC基因的差异，即可用于转玉米PEPC基因 到水稻中的辅助选育，从而有利于加快育种进度和提高选择效率。 主要参考文献： 1.Hudspeth等，PlantPhysiology，1992,98 (2) : 458-464 ; 2.Ku等，NatureBiotechnology，1999,17:76-80 ; 3?焦德茂等，作物学报，2001，27(2) : 137-143 ; 4.李霞等，江苏农业学报，2001，17(3):143-147; 5?王德正等，中国农业科学，2002,35(10) :1165-1170 ; 6.刘峰等，应用与环境生物学报，2005，11(4):393-398 7?高东迎等，江苏农业学报，2006, 22(1) :5-9 8.何立斌等，中国水稻科学，2006,20(1):31-35; 9.袁定阳等，杂交水稻，2007,22(2):57-63; 10.丁在松等，作物学报，2007,33(5):717-722 11.张边江等，中国农业科学，2008,41(10):3008-3014 12?向珣朝等，中国水稻科学，2009,23⑶：257-262; 13?张彬等，AgriculturalScience&Technology，2009,10 (2) :26_28 14.李艳等，麦类作物学报，2009,29(5):740-746 15?张庆琛等，麦类作物学报，2010, 30(2) : 194-197 16?周宝元等，作物学报，2011，37(1) :112-118 ; 17?张建红等，麦类作物学报，2012, 32(6) : 1043-1049 18.杜西河等，分子植物育种，2013,23(11):477-484 19?李万昌等，湖北农业科学，2014, 53(1) :23-24, 37
技术实现思路
技术问题 本专利技术的目的是提供玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特异SSR标记，旨在提 高转任何玉米PEPC基因水稻分子标记辅助选择的效率。 技术方案 为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。 -种玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特异SSR标记，其特征在于，该标记PC9 的引物正反引物序列如下：正向引物 5' -3' ：ATTCCTCCAAACGAGCCCTA，反向引物 5' -3' ：CTGGTAAATGACGATTCCGC。 所述玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特异SSR标记的应用，是指任何玉米磷 酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特异SSR标记在水稻育种中的应用。包括以下步骤： 1)提取水稻、玉米基因组DNA和/或RNA或cDNA; 2)使用所述权利要求1所述基因标记PC9的引物正反引物序列PCR扩增水稻、玉 米基因组DNA和/或RNA或cDNA; 3)电泳检测扩增产物，如果出现131bp的单条带，则表示水稻品种中含纯合的玉 米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因；如果出现340bp的单条带，则表示水稻品种中不含有玉 米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因；如果同时出现131bp和340bp两个条带，则表示水稻品种 为玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因杂合体。 其中，步骤2)中PCR扩增具体操作为：PCR扩增采用20yL反应体系：模板DNA或 RNAScDNA1.0yL，10XPCRBufTer(1.5mMMg2+)2.0yL，2m]\^9d本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特异SSR标记，其特征在于,该标记PC9的引物正反引物序列如下：正向引物5′ ‑3′ ：ATTCCTCCAAACGAGCCCTA，反向引物5′ ‑3′：CTGGTAAATGACGATTCCGC。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张启军，吕川根，夏士健，宗寿余，张志明，虞德容，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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