本发明专利技术涉及玉米丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）基因的专一性SSR标记及其应用，属于生物技术领域。所述玉米PPDK基因的专一性SSR标记PK15正反引物序列如下：正向引物为（5’-3’）TGAGAAAGTGTTCGCCA，反向引物为（5’-3’）TCATCAGCCACCAGAGC。所述应用方法包括1)提取水稻、玉米基因组DNA和/或RNA或cDNA；2）使用所述正反引物序列，PCR 扩增转玉米PPDK基因水稻、玉米基因组DNA和/或RNA或cDNA；3）电泳检测扩增产物。本发明专利技术通过该标记辅助选择，可以准确地将任一玉米中的丙酮酸磷酸双激酶基因转育到水稻品种中去，极大地提高转所有玉米PPDK基因水稻的选育效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及玉米丙酮酸磷酸双激酶基因的专一性SSR标记及其应用，属于生物技 术领域。
技术介绍
C4植物具有低光呼吸、高氮素和水分利用效率、高光能利用效率的优点；与C4光合 有关的酶在对生物和非生物逆境（如机械创伤、低温、盐害及紫外辐射）的防御反应中也有 较重要的作用。由于主要粮食作物如水稻与小麦等C3植物不具有这些优势，人们就希望将 c4这些优势特征引入水稻等c3作物中。丙酮酸磷酸双激酶（proK)是(：4植物光合作用的 关键酶，主要功能是催化〇)2原初受体磷酸烯醇式丙酮酸（PEP)的再生，其中PEP参与固定 〇)2及碳骨架的形成。在C4种子发育过程中，PPDK参与淀粉合成、淀粉一蛋白平衡等重要生 物学过程（王珍梅等，2012;董洋等，2013)。国内外对该基因的研究报道比较多，已有不少 将玉米PPDK基因成功转入水稻中或克隆不同玉米品种（系）PPDK基因的报道（焦德茂等， 2001 ;王德正等，2002 ;袁莉民等，2006 ;张建福等，2006 ;袁定阳等，2007 ;张边江等，2008 ; 王重等，2010 ;宋涛等，2013 ;龚付全等，2014)。这些转基因水稻的C02补偿点和光呼吸速率 显著降低，表观净光合速率提高，产量也有不同程度的提高。 为了加快转PPDK基因水稻的选育进程，利用分子标记进行辅助选择是一种比较 快速、适用的技术。一些文献对玉米PPDK基因开发了分子标记进行基因检测（张建福等， 2006 ;袁定阳等，2007;张边江等，2008;龚付全等，2014)。但这些分子标记的碱基序列要么 位于非编码区，要么跨叠非编码区，不利于基因表达分析（转基因的重要目的之一就是希 望目的基因能正常表达）；而且这些标记在不同玉米品种之间或者不同水稻品种之间存在 着差异，不能快速、简单、高效地区分所有玉米PPDK基因与水稻PPDK基因的差异。截止目 前，还未见一个只针对玉米PPDK基因筛选用的专一分子标记的报道。本专利利用NCBI数 据库中有关所有玉米和水稻PPDK基因编码区的遗传信息，通过序列比对软件DNAStar分析 发现，玉米与水稻之间在PPDK基因上差异众多，基本上没有办法进行引物设计，而且不同 玉米品种（系）之间也具有很多差异位点，几乎没有超过50bp完全比对上的位置，这也为 玉米专用PPDK基因引物提出了很大的挑战。于是，我们试着从另外一个角度去考虑这个问 题，选用经典玉米品种B73的PPDK基因（NC_024464)的序列作为参考序列，首先比较不同 品种（系）玉米的PPDK基因在编码区即18个外显子上的差异，其中第2，11和18这3个 外显子序列比较短（彡90bp)，不利于SSR引物设计；第1、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、16 和17外显子在不同玉米品种（系）中差异就比较大，也不适合设计用于只针对玉米PPDK基 因的通用引物；而外显子15(以玉米品种B73为例，9445-9573,129bp)在NCBI数据库比对 中偶然发现该序列在已报道的所有玉米品种（系）中的碱基序列完全一致，遂利用Primer 5. 0软件对该129bp的碱基序列进行引物设计，其中第39-128bp之间（前后引物各17bp) 具有比较好的SSR引物特征，再把第39-128bp之间这90bp的碱基序列放入NCBI数据库的 水稻基因组中进行比对，没有任何比对结果，说明利用该引物（命名为PK15)在水稻中没法 扩增出相应的90bp长度的片段（图1和图2)，随后合成该引物，进行PCR扩增，结果表明该 引物只在玉米或转玉米PPDK基因水稻中有90bp的扩增片段出现，而在各种不同水稻品种 中没有扩增条带，这为转任何玉米品种（系）的PPDK基因用于水稻育种分子标记辅助选择 提供了一个简单、统一的标准，有利于加快转玉米PPDK基因在水稻育种上的应用。 主要参考文献：焦德茂等，作物学报，2001，27(2) : 137-143 王德正等，中国农业科学，2002, 35(10) : 1165-1170 袁莉民等，中国农业科学，2006,39(5):902-909 张建福等，分子植物育种，2006,4(5):655-662 张建福等，分子植物育种，2006,4(6) :797-804 袁定阳等，杂交水稻，2007,22(2):57-63 张边江等，中国农业科学，2008,41(10):3008-3014 王重等，新疆农业科学，2010,47(12) :2354-2360 王真梅等，植物生理学报，2012,48(10):949-957 董洋等，黑龙江大学自然科学学报，2013,30(5):642-652 宋涛等，江苏农业科学，2013,41(1) :58-61 龚付全等，热带生物学报，2014,5(4):326-333
技术实现思路
技术问题 本专利技术的目的是提供玉米PPDK基因专一性SSR标记及其应用，在转玉米PPDK基 因水稻的分子标记辅助选择育种中提高选育效率。 技术方案 为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。 一种玉米丙酮酸磷酸双激酶基因的专一性SSR标记，其特征在于该标记PK15的正 反引物序列如下： 正向引物 5' -3' ：TGAGAAAGTGTTCGCCA， 反向引物Y-3^ :TCATCAGCCACCAGAGC。 所述玉米丙酮酸磷酸双激酶基因的专一性SSR标记在水稻育种中的应用，包括以 下步骤： 1)提取水稻、玉米基因组DNA和/或RNA或cDNA; 2)使用权利要求1所述标记PK15的正反引物序列，PCR扩增转玉米PPDK基因水 稻、玉米基因组DNA和/或RNA或cDNA; 3)电泳检测扩增产物，如果出现90bp的条带，则表示该材料基因组中含有玉米丙 酮酸磷酸双激酶基因；如果在转玉米PPDK基因水稻的后代植株中没有出现90bp的条带，则 表示该材料基因组中不含有玉米丙酮酸磷酸双激酶基因。其中，步骤2)PCR扩增具体操作 为：PCR采用 20yL反应体系：模板DNA或RNA1. 0yL，10XPCRBuffer2. 0yL，Buffer中 含 1. 5mMMg2+，2mM的dNTP2. 0yL，0. 2yM的引物 2. 0yL，Taq酶 1U，加ddH20补至 20yL; ?〇?扩增条件为：（1)94°(：预变性5111111;(2)94°(：变性308,49.1°(：退火308,72°(：延 伸30s，扩增35个循环；（3) 72°C延伸lOmin，4°C保温。 有益效果 本专利技术的优点是： 1)本专利技术所获得的标记是根据玉米PPDK基因内部编码区碱基序列设计的引物， 为基因自身标记，故不存在遗传交换，不需要作表型鉴定。 2)由于PK15标记位于玉米PPDK基因的第15个外显子区域，无论是利用基因组 DNA进行检测，还是利用RNA或cDNA进行表达检测，其结果都是准确可靠的。 3)本专利技术的标记为共分离标记，可鉴别玉米PPDK基因存在与否，实验重复性好， 结果可靠。 4)由于该标记两端所在的DNA序列在所有玉米品种（系）基因组中高度保守一 致，该标记具有专一性与通用性，在转任一玉米PPDK基因研究中无需再开发新标记即可利 用该标记进行分子标记辅助选择。 5)利用本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种玉米丙酮酸磷酸双激酶基因的专一性SSR标记，其特征在于，该标记PK15的正反引物序列如下：正向引物5′ ‑3′ ：TGAGAAAGTGTTCGCCA，反向引物5′ ‑3′ ：TCATCAGCCACCAGAGC。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张启军，吕川根，宗寿余，夏士健，张志明，虞德容，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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