本发明专利技术属于野牛草分子育种技术领域，具体涉及一套野牛草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应最佳体系。本发明专利技术提供如下的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系：每２５μＬ的反应体系中含有１×ＰＣＲ缓冲液，ｄＮＴＰｓ ０．３ｍＭ，Ｔａｑ酶１．０Ｕ，如ＳＥＱ ＩＤ １～７所示引物中的任一引物０．６μＭ，Ｍｇ２＋ ２．０ｍＭ，ＤＮＡ模板５０ｎｇ；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：９４℃预变性３ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５０～６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，循环３５次，７２℃再延伸４ｍｉｎ。本发明专利技术提供的野牛草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ稳定性好，清晰度高而且增加了条带的丰富度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于野牛草分子育种
，具体涉及一套野牛草ISSR-PCR反应最佳 体系。
技术介绍
野牛草(Buchloe dactyloides)是禾本科画眉草亚科野牛草属多年生草坪草，近 一百年里它主要被当作牧草种植，但由于其具有很多优良特性及较好的坪用价值(如耐 旱、植株低矮、叶片纤细柔软等)而逐渐被用于草坪种植，而且与其它草坪草种相比没有较 明显的病害。随着水资源的日益短缺及公众对环境要求的日益重视，野牛草草坪由于具有 很强的耐旱性而逐渐被人们所重视。由于其优越的抗旱性及适应性，成为我国华北、东北、 西北等地区园林绿化、环境保护、水土保持的主要草种之一。目前野牛草育种技术采用的 仍然是传统的选择育种、诱变育种等方法，使得野牛草品种的遗产基础日益狭窄，一些重要 的性状如耐旱性、品质、耐热性等均有不同程度的丢失，从而限制了我国野牛草育种业的发 展。分子标记辅助选择(molecular maker-assisted selection)是根据目标性状的 分子标记，对育种后代进行选择的一种育种方法，其基本原理是利用与目标基因紧密连锁 或表现共分离关系的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，从而减少连锁 累赘，获得期望的个体，达到提高育种效率的目的。由于分子标记不受环境条件的影响，能 够快速有效地选择出带有目标性状的单株、加快优良基因的聚合和提高作物数量性状的选 择，因而这种方法可以提高育种选择的准确性，缩短育种周期，加快育种进程。简单重复区间序列标记(ISSR)，是以微卫星为引物的PCR分子标记，它直接对基 因组DNA进行分析，不受任何环境条件影响。它用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列 的3’端或5’端加上2 4个随机核苷酸，在基因组上只有与锚定的核苷酸匹配的位点才 能被靶定，避免了 SSR在基因组中的滑动，大大地提高了 PCR扩增的专一性。ISSR引物开发 费用低，操作简单，比RAPD和RFLP能揭示更高的多态性。它在牧草遗传连锁图谱的构建、 基因定位、种质资源鉴定、牧草进化和遗传多样性的分析、分子标记辅助选择等方面得到越 来越广泛的应用。ISSR分子标记试验的关键在于对反应体系和试验条件的优化。不同的材 料的ISSR-PCR体系存在着很大差异，DNA模板的浓度和纯度、引物和dNTP、Taq酶的用量和 商品型号、Mg2+浓度，引物的浓度、反应时间和PH值大小等诸多因素都会影响试验的结果。近年来畜牧业有了很大发展，ISSR标记技术在牧草研究中相继使用，但是目前国 内外关于野牛草ISSR标记技术的报道还很少，只有刘莉等运用ISSR研究野牛草实生群体 多样性的表型。其所选择的ISSR-PCR反应体系为(20 μ L) =IXPCR buffer缓冲液、0. 2mM dNTPsU.OU Taq酶、0.5μ M引物、2. OmM Mg2+、DNA模板30ng，清晰度和条带丰富度稍有欠 缺。总体而言，野牛草资源的研究和其它牧草相比还存在很大的差距。因此建立野牛 草的科学合理的ISSR-PCR反应体系，寻求最佳理论组合，既可以加快试验进程，为后续工作提供科学的依据和指导作用，又可以提高分子标记辅助育种的效率，缩短育种年限。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种野牛草ISSR-PCR反应体系及其应用。其中，每25 μ L的反应体系中含有IXPCR缓冲液，dNTPs 0. 3mM, Taq酶1. 0U, SEQ IDNo. 1 7引物中的任一引物0. 6 μ Μ, Mg2+ 2. OmM, DNA模板50ng ；将上述反应混合液按如 下程序进行扩增94°C预变性 3min，94°C变性 30s，50 60°C退火 30s，72°C延伸 2min，循环 35 次， 72°C再延伸4min。优选的退火温度根据所选择的引物来确定，具体如下SEQ ID No. 1 52. 8 °C SEQ ID No. 2 49. 9 °CSEQ ID No. 3 57. 7 °CSEQ ID No. 4 49. 9 °CSEQ ID No. 5 57. 7 °CSEQ ID No. 6 48. 8 °CSEQ ID No. 7 57. 7C。本专利技术提供的野牛草ISSR-PCR反应体系多态性丰富，背景清晰且信号强。本专利技术较为细致地进行了野牛草ISSR-PCR反应体系的建立与优化工作，确定了 适合野牛草的ISSR-PCR最佳反应体系，大大提高了试验的准确性和稳定性，缩短了育种年 限。本专利技术以ISSR标记为起点，弥补了国内外对野牛草遗传多样性研究的不足，专利技术成果 可用于野牛草杂交育种、遗传关系、分子标记辅助育种、新品种选育等方面，具有很大的科 学价值与应用价值。附图说明图1为ISSR-PCR探索性正交试验图。其中M表示DL2000 Marker ； 1-9表示处理 组合1-9。图2为ISSR-PCR细调性正交试验图。其中M表示DL2000 Marker ； 1-9表示处理 组合1-9。图3两种反应体系结果的比较。其中M表示DL2000 Marker ； 1_9表示处理组合 1-9。图4为引物TPlO最佳退火温度的确定。 具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神 和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1野牛草基因组DNA提取(1)取新鲜野牛草叶片Ig左右，清水洗净、擦干，剪碎放入研钵，随后倒入液氮致冷、研磨；(2)将研磨后的粉末加入65°C的2 X CTAB提取液900 μ L，65°C水浴30min ；(3)冷却后加入500 μ L氯仿/异戊醇(体积比24 1)；(4) 8000rpm 下离心 IOmin ；(5)取上清液； (6)重复(4)、(5) 一次；(7)加入1/10体积的3M醋酸钠和等体积的异丙醇，摇勻，冰上放置5min以上至出 现絮状沉淀；(8) 12000rpm下离心15min，倒掉上清液；(9)用75%酒精清洗，室温干燥Ih后溶于TE缓冲液4°C保存备用。实施例2 ISSR-PCR正交体系(25 μ L)的建立与优化根据正交设计原理，采用L9(34)正交设计表，首先对dNTPs、Taq酶、引物和Mg2+ 浓度进行4因素3水平的探索性正交试验，探索性正交设计表见表1 ；再根据探索性正交 试验的结果，缩小各个引物的浓度梯度进行细调性正交试验，细调性正交设计见表3。所 选 ISSR-PCR 引物序列为 5 ‘ -AGAGAGAGAGAGAGAGYG-3 ‘ [Y = (C，T)]，试验设 2 次重复。 ISSR-PCR扩增程序94°C预变性3min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸2min，循环35 次，72 °C再延伸4min，最后4°C保存。2. 1探索性ISSR-PCR反应体系的建立探索性ISSR-PCR反应体系的正交试验设计见表1。表2探索性正交试验设计[L9 (34)]单位μ L处理组合 dNTPsTaq酶 引物 Mg2+ _(IOmM)(5U/gL)(ΙΟμΜ)(25mM)10.250.10.51.020.250本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种野牛草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，其特征在于，每２５μＬ的反应体系中含有１×ＰＣＲ缓冲液，ｄＮＴＰ ０．３ｍＭ，Ｔａｑ酶１．０Ｕ，引物０．６μＭ，Ｍｇ↑［２＋］ ２．０ｍＭ，ＤＮＡ模板５０ｎｇ；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：９４℃预变性３ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５０～６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，循环３５次，７２℃再延伸４ｍｉｎ。
【技术特征摘要】
一种野牛草ISSR PCR反应体系，其特征在于，每25μL的反应体系中含有1×PCR缓冲液，dNTP 0.3mM，Taq酶1.0U，引物0.6μM，Mg2+ 2.0mM，DNA模板50ng；将上述反应混合液按如下程序进行扩增94℃预变性3min，94℃变性30s，50～60℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次，72℃再延伸4min。2.根据权利要求1所述的ISSR-PCR体系，其特征在于，所述的引物选自SEQID No. 1 7中的任一条。3.根据权利要求1所述的ISS...
【专利技术属性】
技术研发人员：张蕴薇，杨富裕，魏小兰，邓波，康俊梅，沈紫微，邓由飞，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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