一种超高麦芽糖浆的制备方法及其专用酶制剂技术

一种超高麦芽糖浆的制备方法及其专用酶制剂，属于淀粉糖生成技术和微生物基因工程技术领域。用本发明专利技术提供的真菌ａ－淀粉酶ＲｏＡｍｙ，以各种植物淀粉质为原料，淀粉乳经耐高温酸性ａ－淀粉酶液化后，冷却至５５－６５℃，调整ｐＨ为４．５－６．５，加入真菌ａ－淀粉酶ＲｏＡｍｙ，保温３０－６０小时，制得６５％－７５％的超高麦芽糖浆；所用真菌ａ－淀粉酶ＲｏＡｍｙ，其基因来源于米根霉，通过基因工程手段获得重组的真菌ａ－淀粉酶ＲｏＡｍｙ。本发明专利技术还提供了ＲｏＡｍｙ基因用酵母进行高效制备的方法。用真菌ａ－淀粉酶ＲｏＡｍｙ对淀粉进行糖化获得超高麦芽糖浆，与传统的超高麦芽糖制备方法相比较，具有工艺简单，成本低廉，利于放大等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种超高麦芽糖浆的制备方法及其专用酶制剂，更详细地说是涉及一 种超高浓度麦芽糖浆的制备方法及其专用酶制剂的基本特性和制备方法，属于淀粉糖生成 技术和微生物基因工程

技术介绍
麦芽糖浆是以淀粉质为原料，经酶、或酸与酶结合的方法水解而成的以麦芽糖为 主的糖浆，根据麦芽糖的含量不同大致可以分为饴糖(麦芽糖含量20%-30%)、高麦芽糖浆 (麦芽糖含量40%-60%)、超高麦芽糖浆(麦芽糖含量大于65%)和结晶麦芽糖等。高麦芽糖浆的甜度低而温和，可口性强，在高温和酸性条件下比较稳定，具有熬煮 温度高、不易发生美拉德反应等优点。在食品行业，对面包、糕点、烘焙食品等加工过程具有 防止淀粉老化、保湿、延长保质期等作用；在蜜饯、方便食品、酱油、糖果、口服液、保健饮品、 麦乳精、冷冻食品等食品行业作为营养甜味剂、填充剂得到广泛应用；在医药行业，可添加 至多种中药中使用，具有润肺、补虚、止咳、治疗腰痛等作用。此外，超高麦芽糖浆在加氢氢 化后可生成麦芽糖醇，麦芽糖醇是一种甜度和蔗糖相当而热量值较低的甜味剂，也是制备 另一种功能性食品原料麦芽糖酮糖和低聚异麦芽糖的原料。目前，欧美各国大多采用真菌a_淀粉酶(结合b_淀粉酶和普鲁兰酶)做为糖化剂 来生产高麦芽糖浆，得到的麦芽糖浆其组成中麦芽糖占40%-60%，麦芽三糖约10%-20%，其 它为葡萄糖及其它低聚糖和糊精等。对超高麦芽糖浆的生产，在糖化过程中则需要b—淀粉 酶、支链淀粉酶、异淀粉酶或麦芽糖生成酶等酶制剂的协同作用。目前，国内外在制备高麦芽糖浆的过程中所使用的真菌a_淀粉酶均为米曲霉 (A. oryzae)所生产，使用此酶的缺点是必须结合其它酶种一起使用，且在所制备的高麦芽 糖浆中仍含有较高浓度的麦芽三糖(约10%_20%)。在超高麦芽糖浆生产中，糖化过程中必须 有多种酶制剂协同作用，工艺复杂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备超高麦芽糖浆的方法及其专用酶制剂的基本特性 和制备方法，以达到简化超高麦芽糖浆制备工艺的目的。本专利技术提供的一种制备超高麦芽糖浆的方法，是能以多种淀粉质(大米淀粉、玉米 淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉)为原料，经液化后通过单一酶种进行糖化，直接制 备超高麦芽糖浆，麦芽糖含量可达65%_75%。本专利技术提供的一种专用酶制剂的制备方法，是一种特殊的真菌a_淀粉酶RoAmy， 通过基因工程手段从米根霉(ATCC9363)基因组中获得真菌a_淀粉酶RoAmy编码基因，并 在黑曲霉菌株或酵母菌株中实现过量表达，通过微滤、超滤等手段获得液态酶制剂。本专利技术的技术方案一种制备超高麦芽糖浆的专用酶制剂真菌淀粉酶RoAmy， 其通过基因工程手段构建重组体细胞实现来源于米根霉(ATCC9363)的一种真菌a-淀粉酶基因的过量表达，其基因编码为SEQ ID NO: 1。一种利用所述真菌a-淀粉酶RoAmy制备超高麦芽糖浆的方法，以植物淀粉质为原 料，利用真菌a-淀粉酶RoAmy进行糖化而直接获得超高麦芽糖浆；工艺为1)液化在质量浓度为10%-30%，pH为4.5-6. 5的淀粉乳中加入耐高温酸性淀粉酶， 酸性a-淀粉酶用量为2-8 LU/g干淀粉，于95-105°C液化10-25分钟，135°C灭酶5分钟， DE值控制在1-8之间；2)糖化液化后冷却至55-65°C，加入真菌a-淀粉酶RoAmy，用量为4_15U/g干淀粉， 糖化30-60小时，经脱色、离子交换、真空浓缩，得到质量浓度65%-75%的超高麦芽糖浆，其 中葡萄糖含量为7%-13%，几乎不含麦芽三糖和其它低聚糖。本专利技术提供的一种专用酶制剂真菌a-淀粉酶RoAmy的制备方法包括以下步骤 (1)使用反转录PCR试剂盒提取米根霉(ATCC9363，Lactate and EthanolProductions by Rhizopus oryzae ATCC 9363 and Activities of Related Pyruvate Branch Point Enzymes” JOURNAL of BI0SCHENCE AND BIOENGINEERING Vol 102，No. 5， 464-466，2006.已公开)菌丝组织总RNA并扩增得到大小为1. 4 kb的RoAmy基因的 cDNA片段，回收并克隆入pMD19 (大连宝公司)，在大肠杆菌JM 109中构建得到重组质粒 pMD-W耶，提取重组质粒并使用T-载体通用引物测序，获得淀粉酶的编码基因序列SEQ ID NO: 1。其中ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。根据以上核苷酸序列，获得该淀粉酶氨基酸组成为SEQ ID NO: 2。该淀粉酶由462个氨基酸组成，从蛋白质一级结构分析，该蛋白质前20个氨基酸 为信号肽序列，成熟肽含有三个糖基化位点Asn和淀粉酶所具有的四个典型的保守区域 Asp Val Val Ala Asn His、Asp Gly Leu Arg lie Asp Thr Val Lys His Val.Gly Glu Val Leu Ser 禾口 Phe lie Asp Asn His Asp。(2)将该淀粉酶编码基因插入表达载体(pPIC9K-W jO，通过电转化方式导入相 应的表达宿主(黑曲霉或酵母菌株)中得到相应的重组体细胞；(3)对重组体细胞进行发酵，发酵液经微孔滤膜过滤去除菌体，微滤液再通过超滤膜浓 缩，以制备真菌a-淀粉酶RoAmy。本专利技术的有益效果本专利技术与现有技术相比，具有以下特点1、本专利技术在制备超高麦芽糖浆过程中，在糖化步骤中只使用一种真菌a-淀粉酶 RoAmy,麦芽糖浓度可达65%-75%，几乎不含有麦芽三糖和其它低聚糖，与常规超高麦芽糖浆 的制备工艺相比，不需要其它酶制剂的协同作用，具有工艺简单、生产成本低等特点。2、本专利技术中提供了一种特殊的米根霉来源的真菌a-淀粉酶RoAmy的制备方法，通 过该酶制剂将淀粉质糖化后，可直接制备超高麦芽糖浆，且产物中几乎不含有麦芽三糖和 其它低聚糖，与传统麦芽糖浆制备工艺中使用的米曲霉来源的真菌淀粉酶相比，具有麦 芽糖生成能力强，产物相对单一等特点。附图说明图1 酵母表达真菌a-淀粉酶RoAmy的表达载体；图2 重组酵母表达真菌a_淀粉酶RoAmy的蛋白质电泳图谱；4图3 重组真菌a-淀粉酶RoAmy的最适反应温度； 图4 重组真菌a-淀粉酶RoAmy的最适反应pH ； 图5 重组真菌a-淀粉酶RoAmy的热稳定性测定； 图6 重组真菌a-淀粉酶RoAmy的pH稳定性测定。具体实施例方式实施例1 超高麦芽糖浆的制备液化将100千克玉米淀粉，调制成浓度为10%-30%的淀粉乳，调整PH为4. 5-6. 5，加 热至95-105°C，添加耐高温酸性a-淀粉酶，淀粉酶用量为2_8 LU/g干淀粉，液化10-25分 钟，135°C灭酶5分钟，控制DE值在1-8之间；糖化液化后冷却至55-65°C，加入真菌a_淀粉酶RoAmy，用量为4_15 U/g干淀粉，期 间使用高压液相色谱(HPLC)法测定葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖生成量，糖化30-60小时 后，经脱色、离子交换、真空浓缩至浓度70%-80%，制得125-140千克麦芽糖含量为65%_75% 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备超高麦芽糖浆的专用酶制剂真菌ａ－淀粉酶ＲｏＡｍｙ，其特征在于，通过基因工程手段构建重组体细胞实现来源于米根霉ＡＴＣＣ９３６３的一种真菌ａ－淀粉酶基因的过量表达，其基因编码为：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１。

【技术特征摘要】
一种制备超高麦芽糖浆的专用酶制剂真菌a 淀粉酶RoAmy，其特征在于，通过基因工程手段构建重组体细胞实现来源于米根霉ATCC9363的一种真菌a 淀粉酶基因的过量表达，其基因编码为SEQ ID NO: 1。2.一种利用权利要求1所述真菌淀粉酶RoAmy制备超高麦芽糖浆的方法，其特征 在于以植物淀粉质为原料，利用真菌淀粉酶RoAmy进行糖化而直接获得超高麦芽糖浆； 工艺为1)液化在质量浓度为10%-30%、pH为4.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王正祥，石贵阳，李松，
申请(专利权)人：江苏锐阳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32