本发明专利技术公开一种灰产色链霉菌海藻糖合成酶及其编码基因与应用，该海藻糖合成酶基因从灰产色链霉菌（Streptomyces?griseochromogenes）克隆到，该海藻糖合成酶能转化麦芽糖生成海藻糖，酶的适合反应温度为15～35℃，优选20～25℃，酶的适合应的pH在6.0～8.0，优选pH为7.0～7.5。该酶转化效率高，以麦芽糖为底物，在25℃反应条件下，麦芽糖在转化率达80％左右，及产生较少的葡萄糖，在5％以下，这有利提高底物的转化率，该酶能够用于转化商品化的超高麦芽糖浆制备海藻糖，可为工业化利用酶法生产海藻糖提供一种新的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和现代酶工程
，具体涉及ー种来自灰产色链霉菌的海藻糖合成酶及其编码基因和应用。
技术介绍
海藻糖(Trehalose)是由两分子葡萄糖以α，α _1，I糖苷键相连而成的非还原性ニ糖，是ー种安全、可靠的天然糖类，1832年由Wiggers将其从黑麦的麦角菌中首次提取出来，随后的研究发现海藻糖在自然界中许多可食用动植物及微生物体内都广泛存在，如人们日常生活中食用的蘑菇类、海藻类、豆类、虾、面包、啤酒及酵母发酵食品中都有含量较高的海藻糖。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干 燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。外源性的海藻糖同样对生物体及生物大分子、生物膜具有良好的非特异性保护作用，它可以保护细胞免受由于环境变化(如脱水、高滲)造成的损害，具体表现为对生物膜、蛋白质和DNA等的有效保护，海藻糖因此在科学界素有“生命之糖”的美誉。国际权威的《自然》杂志曾在2000年7月发表了对海藻糖进行评价的专文，文中指出“对许多生命体而言，海藻糖的有与无，意味着生命或者死亡”。这ー独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料，大大拓展了海藻糖作为天然食用甜味糖的功能。在医学上已经成功地应用海藻糖替代血浆蛋白作为血液制品、疫苗、淋巴细胞、细胞组织等生物活性物质的稳定剂。不仅可以常温条件下干燥存放，更重要的是可以防止因血源污染而引起こ肝、艾滋病等致命疾病的传播，世界卫生组织对此十分重视。可见海藻糖的广泛应用可以提高人类的生活和健康水平。在上世纪80年代的末期，海藻糖只能从含量甚微的天然微生物中提取，因而价格高达1000美元/kg ;后来，利用酵母提取海藻糖获得成功，使海藻糖价格降低到300美元/kg以下。酵母提取法虽然大大价低了海藻糖的价格，但是无法进行大規模エ业化的生产，同时微生物培养的副产物较多増加了海藻糖精制的困难，回收率也较低，都导致海藻糖的生产成本很难再进ー步降低。1991年，意大利研究人员最早发现ー些耐热古细菌的细胞提取物能将淀粉转化成海藻糖，随后日本研究人员对该酶做了分离纯化的研究，并克隆到相关的海藻糖合成酶基因，实现了利用酶法来生产海藻糖，也使海藻糖价格降低到10美元/kg以下。海藻糖早期昂贵的价格限制了应用与开发的研究，海藻糖价格的降低就意味着海藻糖将更广泛应用于医药食品等行业，这会大大促进相关产业的发展，也会加快海藻糖的应用开发研究。因此，研究开发更有效和生产成本更低的海藻糖生产技术，仍然是海藻糖广泛应用于食品行业要解决的关键性问题。微生物合成海藻糖的途径可以分为三种第一种途径是海藻糖磷酸化酶合成(0TSA-0TSB)途径海藻糖磷酸化酶合成途径先由6磷酸海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，然后再由6磷酸海藻糖酯酶脱磷酸后得到海藻糖。第二种途径是麦芽寡糖基海藻糖合成酶(TreY-TreZ)途径麦芽寡糖基海藻糖合成酶是先由麦芽寡糖基海藻糖合成酶以麦芽糊精(Maltodextrin)为底物,通过分子内转糖基作用把麦芽糊精末端的两个葡萄糖分子间的α, α-1,4糖苷键转变成α，α -1，I糖苷键，形成麦芽寡糖基海藻糖。然后麦芽寡糖基海藻糖在麦芽寡糖基海藻糖水解酶的催化下从麦芽寡糖基海藻糖分子上水解下ー个海藻糖分子，而原来的麦芽糊精则转变为减少了两个葡萄糖基的新寡糖，并可作为新的底物进行下一轮反应，如此反复就可以将麦芽糊精转化成海藻糖。第三种途径是海藻糖合成酶(TreS )途径海藻糖合成酶途径是以麦芽糖(Maltose)为底物，直接由海藻糖合成酶催化转化麦芽糖生成海藻糖。三种途径相比，第一种途径需要用到价格昂贵的高能磷酸化合物UDP-葡萄糖和6_磷酸葡萄糖为底物来生产海藻糖，在生产成本很难产生竞争优势；第二种和第三种途径是以淀粉的水解产物麦芽糊精或者麦芽糖为底物生产海藻糖，在原料上具有很强的竞争优势。第二种途径需要两种酶，在实际生产中要考虑两种酶的生产设备和生产エ艺，还要考虑两种酶的最适反应条件是否一致；而第三种途径只需要ー种酶，在生产设备的占用率会更低，生产エ艺上会更简単，因而具有更强的竞争优势。目前已有不少文献和专利报道了海藻糖合成相关基因的克隆和分离，以及这些海藻糖合成酶基因在制备海藻糖中的应用，但这些海藻糖合成相关酶的合成途径不同，或者菌种来源不同，导致了 DNA序列和氨基酸序列相差甚远，酶的分子量、酶学特性以及酶对底物的转化率也不同，而且目前得到的可エ业化应用的基因和专利不多。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供ー种海藻糖合成酶。本专利技术的另一目的在于提供ー种海藻糖合成酶的编码基因。本专利技术的另一目的在于提供ー种含有上述的海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。本专利技术的又一目的在于提供上述海藻糖合成酶编码基因在表达海藻糖合成酶中的应用。本专利技术的又一目的在于提供ー种海藻糖合成酶及其编码基因在制备海藻糖中的应用。本专利技术的又一目的在于提供一种制备海藻糖的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案实现ー种海藻糖合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本专利技术提供的海藻糖合成酶其编码基因克隆自灰产色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes编号11007),命名为Sg-TreS,具有下述核苷酸序列之一(I)序列表中的SEQ ID NO. I的核苷酸序列；(2)编码序列表中SEQ ID NO. 2氨基酸序列的多核苷酸。本专利技术是通过研究海藻糖合成酶基因的保守序列，然后设计相关的兼并PCR引物从灰产色链霉菌中克隆得到海藻糖合成酶的编码基因。所采用的实验方法，包括聚合酶链式反应(PCR)技术；DNA的提取、酶切、连接等DNA分子操作技术，以灰产色链霉菌总DNA为模板，扩增出一段可能为海藻糖合成酶编码基因的DNA序列(Sg-TreS)，把这一段DNA序列连接到表达载体上如pET-30a等表达质粒上，然后导入大肠杆菌进行高效表达，获得该基因表达的目的蛋白进行研究，确定基因的功能和酶学特性，证实了这一段DNA序列编码的是ー种特性特征与前人发现不同的海藻糖合成酶。这些不同的特性特征包括基因来源不同、DNA序列和氨基酸序列的不同、酶的分子大小不同、酶的最适反应温度和最适pH不同。目前尚无检索到公开的文献和专利等关于从灰产色链霉菌中克隆得到海藻糖合成酶基因 的报道，或者是关于利用灰产色链霉菌制备海藻糖的报道，因此可以判断本专利技术属于ー种新专利技术。从灰产色链霉菌得到的海藻糖合成酶具有以下特征I.该海藻糖合成酶的编码基因长度为1716个碱基对，编码572个氨基酸，分子量约为65. 9 kD2.该海藻糖合成酶的适合反应温度为15 35°C，优选2(T25°C3.该海藻糖合成酶的适合应的pH在6. (Γ8. 0，优选pH为7. 0 7. 54. ニ价金属离子的浓度在5m mol/本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种海藻糖合成酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。2.权利要求I所述的海藻糖合成酶的编码基因。3.根据权利要求2所述的海藻糖合成酶的编码基因，其特征在于所述的海藻糖合成酶的编码基因具有下述核苷酸序列之一 (1)序列表中的SEQID NO. I的核苷酸序列； (2)编码序列表中SEQID NO. 2氨基酸序列的多核苷酸。4.含有权利要求2或3所述的海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体为将权利要求2或3所述的海藻糖合成酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达海藻糖合成酶的重组表达载体；所述的大肠杆菌表达载体优选为pET-30a载体。6.根据权利要求4所述的转基因重组菌，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，李霜，江凌，贺沧，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。