ＤＮＡ甲基化测定方法技术

本发明专利技术涉及对生物来源标本中所含的基因组ＤＮＡ中的目标ＤＮＡ区域中甲基化后的ＤＮＡ的含量对进行测定的方法等。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对生物来源标本所含的基因组DNA中的目标DNA区域中甲基化后的 DNA的含量进行测定的方法等。
技术介绍
作为用于对生物来源标本中所含的基因组DNA中的目标DNA区域中DNA的甲基化 状态进行评价的方法，例如有对基因组DNA中的目标DNA区域中甲基化后的DNA的含量进 行测定的方法(例如参照 Nucleic Acids Res (核酸研究).1994 Aug 11 ；22(15) =2990-7, 及 Proc Natl Acad Sci USA. 1997Mar 18 ；94(6) :2284-9)。在该测定方法中，首先，需要 从基因组DNA来源的DNA试样中提取包含目标DNA区域的DNA，提取操作繁杂。另外，作为对所提取的DNA的目标区域中甲基化后的DNA的含量进行测定的方法， 例如已知有(1)在使用亚硫酸盐等修饰该DNA之后供于利用DNA聚合酶的DNA合成的链反 应(Polymerase Chain Reaction (聚合酶链式反应)；以下也会记为PCR。)，由此对目标区 域进行扩增的方法；(2)使用甲基化敏感性限制酶将该DNA消化之后，供于PCR，由此对目 标区域进行扩增的方法等。这些方法均在用于检测甲基化的DNA的修饰及随后的产物的纯 化、用于PCR的反应体系的制备、DNA的扩增的确认等方面耗费工夫。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种对生物来源标本所含的基因组DNA中的目标DNA区 域中的被甲基化了的DNA的含量进行简便测定的方法等。即，本专利技术提供如下所示的专利技术。[专利技术1]一种对生物来源标本所含的基因组DNA中的目标DNA区域中的被甲基化了的DNA 的含量进行测定的方法，其具有(1)第一工序，对生物来源标本所含的基因组DNA来源的DNA试样实施利用甲基化 敏感性限制酶的消化处理；(2)第二工序，从在第一工序中得到的经过消化处理的DNA试样取得甲基化后的 单链DNA，使该单链DNA和固定化甲基化DNA抗体结合而选择单链DNA ；及(3)第三工序，具有前步骤和本步骤，作为下述的各本步骤的前步骤，具有将由 第二工序选择的单链DNA从固定化固定化甲基化DNA抗体分离而成为单链状态的DNA(正 链)的步骤(第一前步骤)；使用在第一前步骤中成为单链状态的基因组来源的DNA(正链)，并使用延伸引 物(正向引物)作为延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使包含目标DNA区域的单链 DNA(正链)延伸形成为双链DNA的工序(第二前步骤)，所述延伸引物(正向引物)中有 相对于单链状态的DNA(正链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(正链)具有互补性的 碱基序列(负链)，该部分碱基序列(正链)与上述目标DNA区域的碱基序列(正链)的3’末端相比更靠近3’末端侧；和将在第二前步骤中延伸形成了的双链DNA，暂时分离成包含目标DNA区域的单链 DNA(正链)和包含相对于目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链)的工序 (第三前步骤)；并且，作为本步骤，具有(a)第A步骤(本步骤)，其以生成的包含目标DNA区域的单链DNA(正链)为模 板，将上述正向引物用作延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使上述的包含目标DNA区 域的单链DNA延伸形成为双链DNA ；和(b)第B步骤(本步骤)，其以包含相对于已生成的目标DNA区域具有互补性的碱 基序列的单链DNA(负链)为模板，以延伸引物(反向引物)为延伸引物，使该延伸引物延伸 一次，由此使上述的包含目标DNA区域的单链DNA延伸形成为双链DNA，所述延伸引物(反 向引物)中有相对于包含与上述目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链) 所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)具有互补性的碱基序列(正链)，该部分碱基 序列(负链)与相对于上述目标DNA区域的碱基序列(正链)具有互补性的碱基序列(负 链)的3’末端相比更靠近3’末端侧；进而在将由上述各本步骤得到的经延伸形成的双链DNA暂时分离成单链状态之 后反复进行第三工序的各本步骤，由此对上述目标DNA区域中甲基化后的DNA进行扩增直 至达到可以检测的量，对被扩增的DNA的量进行定量。[专利技术2]就专利技术1记载的方法而言，固定化固定化甲基化DNA抗体是甲基胞嘧啶抗体。[专利技术3]就专利技术1或2记载的方法而言，生物来源标本为哺乳动物的血液、体液、血清、血 浆、细胞溶解液或组织溶解液。[专利技术4]就专利技术1 3中任意专利技术记载的方法而言，生物来源标本中所含的基因组DNA来 源的DNA试样，是预先用不将该基因组DNA所具有的目标DNA区域作为识别切断部位的限 制酶实施消化处理而成的DNA试样、或预先纯化而成的DNA试样。[专利技术5]就专利技术1 4中任意专利技术记载的方法而言，第一工序具有通过混合含有目标DNA区域的单链DNA (正链)、和含有与甲基化敏感性限制酶的 识别部位的碱基序列互补的碱基序列的蔽光(masking)用寡核苷酸，选择该甲基化敏感性 限制酶的识别部位被保护而成的单链DNA的第一(A)步骤、和用甲基化敏感性限制酶对由第一(A)步骤选择的单链DNA进行消化处理的第一 (A)步骤。[专利技术6]就专利技术1 5中任意专利技术记载的方法而言，甲基化敏感性限制酶是在生物来源标 本中所含的基因组DNA所具有的目标DNA区域中具有识别切断部位的限制酶、或Hhal。[专利技术7]就专利技术1 6中任意专利技术记载的方法而言，不进行第一工序中利用甲基化敏感性限制酶的消化处理而进行第二工序。[专利技术8]就专利技术1 7中任意专利技术记载的方法而言，第二工序具有将在第一工序中得到的经过消化处理的DNA试样中所含的甲基化后的双链DNA分 离成甲基化后的单链DNA的第二(A)步骤、和使在第二㈧步骤中得到的甲基化单链DNA和固定化甲基化DNA抗体结合的第二 ⑶步骤；在利用第二(A)步骤将甲基化后的双链DNA分离成甲基化单链DNA时，添加反向寡核苷酸。附图说明图1是表示在实施例1中用PCR从所制备的样品扩增含有用序列编号23表示的 碱基序列的区域中甲基化后的DNA，对得到的扩增产物进行2 %琼脂糖凝胶电泳得到的结 果的图。图中从最左的道起示出以下的标记物和样品的结果，即DNA标记物“MK”、 HpaI I的识别序列被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-M (7)溶液 被实施了 “A”处理的样品“M”、HpaII的识别序列的一部分未被甲基化的部分甲基化 寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-HM(5)溶液被实施了 “Α”处理的样品“H”、未甲基化 寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-UM溶液的被实施了 “A”处理的样品“U”、HpaII的 识别序列被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-M (7)溶液的被实 施了 “B”处理的样品“M”、HpaII的识别序列的一部分未被甲基化的部分甲基化寡核 苷酸GPR7-2079-2176/98mer-HM⑶溶液的被实施了 “ B ”处理的样品“ H”、未甲基化寡 核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-UM溶液的被实施了 “B”处理的样品“U”、HpaII的识 别序列被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对生物来源标本中所含基因组ＤＮＡ中的ＤＮＡ区域的甲基化后的ＤＮＡ的含量进行测定的方法，其特征在于，具有：　　（１）第一工序，对生物来源标本中所含基因组ＤＮＡ来源的ＤＮＡ试样实施利用甲基化敏感性限制酶的消化处理；　　（２）第二工序，从在第一工序中得到的经过消化处理的ＤＮＡ试样取得甲基化后的单链ＤＮＡ，使该单链ＤＮＡ和固定化甲基化ＤＮＡ抗体结合而选择单链ＤＮＡ；及　　（３）第三工序，其具有前步骤和本步骤，　　作为下述的各本步骤的前步骤，具有：　　第一前步骤，将由第二工序选择的单链ＤＮＡ从固定化甲基化ＤＮＡ抗体分离而成为单链状态的ＤＮＡ（正链）；　　第二前步骤，使用在第一前步骤中成为单链状态的基因组来源的ＤＮＡ（正链），并使用下述延伸引物（正向引物）作为延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使包含目标ＤＮＡ区域的单链ＤＮＡ（正链）延伸形成为双链ＤＮＡ，所述延伸引物（正向引物）中有相对于单链状态的ＤＮＡ（正链）所具有的碱基序列的部分碱基序列（正链）具有互补性的碱基序列（负链），该部分碱基序列（正链）与所述目标ＤＮＡ区域的碱基序列（正链）的３’末端相比更靠近３’末端侧；和　　第三前步骤，其中，将在第二前步骤中延伸形成的双链ＤＮＡ，暂时分离成包含目标ＤＮＡ区域的单链ＤＮＡ（正链）和包含相对于目标ＤＮＡ区域具有互补性的碱基序列的单链ＤＮＡ（负链），　　并且，作为本步骤，具有：　　（ａ）第Ａ步骤（本步骤），其以生成的包含目标ＤＮＡ区域的单链ＤＮＡ（正链）为模板，将所述正向引物用作延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使所述的包含目标ＤＮＡ区域的单链ＤＮＡ延伸形成为双链ＤＮＡ；和　　（ｂ）第Ｂ步骤（本步骤），其以包含相对于已生成的目标ＤＮＡ区域具有互补性的碱基序列的单链ＤＮＡ（负链）为模板，以下述延伸引物（反向引物）为延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使所述的包含目标ＤＮＡ区域的单链ＤＮＡ延伸形成为双链ＤＮＡ，所述延伸引物（反向引物）中有相对于包含与所述目标ＤＮＡ区域具有互补性的碱基序列的单链ＤＮＡ（负链）所具有的碱基序列的部分碱基序列（负链）具有互补性的碱基序列（正链），该部分碱基序列（负链）与相对于所述目标ＤＮＡ区域的碱基序列（正链）具有互补性的碱基序列（负链）的３’末端相比更靠近３’末端侧；　　进而在将由所述各本步骤得到的经延伸形成的双链ＤＮＡ暂时分离成单链状态之后反复进行第三工序的各本步骤，由此对所述目标ＤＮＡ区域中甲...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2008-3-25 2008-0779671.一种对生物来源标本中所含基因组DNA中的DNA区域的甲基化后的DNA的含量进行 测定的方法，其特征在于，具有(1)第一工序，对生物来源标本中所含基因组DNA来源的DNA试样实施利用甲基化敏感 性限制酶的消化处理；(2)第二工序，从在第一工序中得到的经过消化处理的DNA试样取得甲基化后的单链 DNA,使该单链DNA和固定化甲基化DNA抗体结合而选择单链DNA ；及(3)第三工序，其具有前步骤和本步骤，作为下述的各本步骤的前步骤，具有第一前步骤，将由第二工序选择的单链DNA从固定化甲基化DNA抗体分离而成为单链 状态的DNA (正链)；第二前步骤，使用在第一前步骤中成为单链状态的基因组来源的DNA(正链)，并使用 下述延伸引物(正向引物)作为延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使包含目标DNA区 域的单链DNA(正链)延伸形成为双链DNA，所述延伸引物(正向引物)中有相对于单链状 态的DNA(正链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(正链)具有互补性的碱基序列(负 链)，该部分碱基序列(正链)与所述目标DNA区域的碱基序列(正链)的3’末端相比更 靠近3’末端侧；和第三前步骤，其中，将在第二前步骤中延伸形成的双链DNA，暂时分离成包含目标DNA 区域的单链DNA (正链)和包含相对于目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA (负 链)，并且，作为本步骤，具有(a)第A步骤(本步骤)，其以生成的包含目标DNA区域的单链DNA(正链)为模板，将 所述正向引物用作延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使所述的包含目标DNA区域的 单链DNA延伸形成为双链DNA ；和(b)第B步骤(本步骤)，其以包含相对于已生成的目标DNA区域具有互补性的碱基序 列的单链DNA(负链)为模板，以下述延伸引物(反向引物)为延伸引物，使该延伸引物延伸 一次，由此使所述的包含目标DNA区域的单链DNA延伸形成为双链DNA，所述延伸引物(反 向引物)中有相对于包含与所述目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA (...

【专利技术属性】
技术研发人员：冨原祥隆，佐藤日出夫，樽井弘和，
申请(专利权)人：住友化学株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]