核糖核酸酶抑制因子在制备肿瘤生长抑制药物中的应用制造技术

一种核糖核酸酶抑制因子作为肿瘤生长抑制剂，它是将在４℃以下纯化的核糖核酸酶抑制因子灭菌、分装制成比活为７００～８３０单位／毫克、蛋白浓度２．５～３．０毫克／毫升的注射针剂，将这种针剂对患肿瘤的肌体进行皮下注射可抑制肿瘤的生长。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白质。核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor简称RI)它能与核糖核酸酶Ribonclease简称RNase)结合并抑制其活力从而具有保护mRNA和rRNA的作用。因此人们将它用作体外实验中保护mRNA的一种试剂。本专利技术的目的在于提供一种利用核糖核酸酶抑制因子易与血管形成因子(angiogenesis)结合的性质将它作为肿瘤生长抑制剂的方法。本专利技术的目的可通过以下措施来实现一种核糖核酸酶抑制因子作为肿瘤生长抑制剂的制备，其采用人胎盘经破碎制成匀浆液，将上清液盐析后置于磷酸盐缓冲溶液中，用透析和DEAE离子交换层析提纯，其特征在于上述过程均在4℃以下进行，再将提纯后的产物灭菌、分装即可得到比活为700～830单位/毫克、蛋白浓度2.50～3.0毫克/毫升的注射针剂。采用用上述方法制备的针剂对患肿瘤的肌体进行皮下注射。透析后加入到Sepharosr-RNase亲合层析柱上，淋洗去掉非专一性吸附的杂蛋白，加洗脱液(PH5.0含3MNacl和5％甘油的0.1MNaAC-HAc缓冲液)继续洗脱。本专利技术所采用的核糖核酸酶抑制因子是一种糖蛋白，分子量约50KD，广泛存在于细胞的可溶性部分。它能与核糖核酸酶结合成复合物，使细胞中的核糖酸酶主要以潜伏形式存在。在核糖核酸酶抑制因子的结构中有11个二硫键和8个游离的巯基。巯基是核糖核酸酶抑制因子的活性必需集团，巯基的氧化会导致核糖核酸酶抑制因子的失活。核糖核酸酶抑制因子还可以与血管形成因子结合，其结合力是与核糖核酸酶结合的100倍，由此抑制血管的生成。新血管的形成在肿瘤的生长和转移中起着重要的作用。实体瘤通过分泌血管形成因子而刺激血管的形成，如果停止血液供应，肿瘤不仅停止生长，而且也不能向循环系统释放癌细胞而转移。本专利技术采用的人胎盘核糖核的酸酶抑制因子(简称PRI)的制备方法是在Blookburn方法的基础上加以改进的。改进后的流程如下1、破碎胎盘采用新鲜的人胎盘，用含0.25M蔗糖的Tris·HCl(PH7.5)缓冲液洗去血，剥去膜和结缔组织，剪碎，用高速匀浆器制备匀浆。2、上清液盐析将匀浆液离心(16,000g，30分钟)取上清液，加固体硫酸铵至35％饱和度，搅拌1小时。16,000g离心30分钟，弃去沉淀，上清液中继续加入固体硫酸铵至60％饱和度搅拌1小时。离心(16,000g，30分钟)弃去上清液，沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中(PH6.4)为核糖核酸酶抑制因子的粗制品。3、用透析和DEAE离子交换层析提纯核糖核酸酶抑制因子在磷酸盐缓冲溶液中(PH6.4)透析过夜后加入到予先用缓冲液平衡好的DEAE-阴离子交换柱上，用同样的缓冲液淋洗后用0.35M氯化钠洗脱。最好用0.15～0.5M氯化钠梯度洗脱。收集，测各管的A280吸收，并测活性。最好再用亲合层析提纯合并活性峰，透析后加入到Sepharose-RNase亲合层析柱上，淋洗去掉非专一性吸附的杂蛋白，加洗脱液(PH5.0含3M NaCl和5％甘油的0.1M NaAc-HAc缓冲液)继续洗脱。并进行核糖核酸抑制因子活力测定。以上的分离纯化过程均在4℃以下进行。4、灭菌、分装将经上述提纯后的核糖核酸酶抑制因子用微孔滤膜过滤灭菌、分装制得注射用针剂。分装于安瓿内的药品最好在冷冻干燥后贮存。制得的核糖核酸酶抑制因子活性测定采用比色法(分光光度法)。测定加入核糖核酸酶抑制因子后核糖核酸酶水解RNA能力的下降。所得核糖酸酶抑制因子比活为700～830u/mg。核糖核酸酶抑制因子的鉴定采用电泳鉴定即用不连续SDS-PAGE电泳，分离胶浓度10％经鉴定离合层析后是一条带。DEAE层析后蛋白浓度为2.5～3.0毫克/毫升。核糖核酸酶抑制因子作为肿瘤生长抑制剂的使用方法对患肿瘤的肌体进行皮下注射，其给药量视给药对象不同而不同，如每只小鼠给药100～300单位，体积0.5～1.5ml。一、核糖核酸酶抑制因子对实体瘤生长的抑制作用。例1RI对小鼠Ca-761乳腺癌实体瘤生长的抑制作用取纯系615小鼠，体重20克左右，腋部皮下植入Ca-761瘤株。30小时后分成两组实验组注射RI(每只小鼠给药1ml，内含RI200单位)，对照组注射生理盐水。注射药的部位为瘤植入部位。继续饲养小鼠，不同时间处死小鼠，取出实体瘤称重。实验结果如下表1注射RI后小鼠的Ca-761瘤株瘤重的比较例2 RI对小鼠S180肉瘤生长的抑制作用取昆明鼠，体重20克左右，雌雄兼用。腋部皮下植入S180肉瘤株0.2ml(细胞数1.0×107/ml)。30小时后随机分成两组实验组注射RI(每只小鼠给药1ml，内含RI200单位)对照组注射生理盐水。注射药的部位为瘤植入部位。继续饲养小鼠，五天后处死，取出实体瘤称重。结果见表2表2注射RI后小鼠的S180肉瘤株瘤重的比较 由表可见，对照组瘤重与给药组瘤重相比有明显差异，表明RI对小鼠S180肉瘤的生长有抑制作用。二、RI的不同剂量及不同给药途径对S180肉瘤生长的抑制作用例3局部给药对S180肉瘤生长的抑制作用方法同例2，其中实验组分为三组，分别注射RI100单位、200单位、300单位，对照组仍为生理盐水，5天后处死小鼠，取出称瘤重，结果见表3。表3不同剂量的RI局部注射对S180肉瘤生长的作用 由表可见，随着给药量的增加，抑瘤效果也明显增强，它们之间的关系可用附图说明图1表示例4腹腔给药对S180肉瘤生长的抑制作用方法同例2，其中实验组分为三组，每组腹腔注射RI各100单位、200单位、300单位，对照组仍注射生理盐水，5且后处死称瘤重，结果见表4表4不同剂量的RI腹腔注射对S180肉瘤生长的作用 <p>由表可见，不同剂量的RI对肿瘤生长抑制作用有所不同，无论局部给药还是腹腔用药均能产生抑制肿瘤的效果。三、小鼠S180肉瘤组织用药后的形态学观察取昆明鼠30只，每只体重20g左右，腋部皮下植入S180肉瘤株。30小时后，随机分成两组，实验组20只，注射RNasin(每只给药200单位)，对照组10只，注射生理盐水。5天后处死小鼠，取瘤、固定、做切片，观察用药后瘤内血管、核分裂数及坏死状况的变化1、瘤组织的坏死状况镜下观察对照组及实验组肿瘤组织的坏死状况。按以下标准分类坏死部分小于1/3瘤组织为轻度坏死；坏死部分大于1/3，小于2/3瘤组织为中度坏死；坏死部分大于2/3瘤组织为重度坏死。分别统计后做X2检验。P＜0.025。说明实验组坏死状况显著高于对照组。这说明，注射RNasin的实验组瘤组织坏死加强。以前的动物实验表明，RNasin有抑制肿瘤生长的作用。本实验在光镜水平上进一步证实了这个结论。并且揭示RNasin抗肿瘤的机理是促进瘤细胞的坏死。2、瘤组织内血管数量的变化观察50个视野，记录血管数目，做t检验组别 切片数 X(血管数/50个视野) P对照 10 30.22 P＜0.05实验 20 16.27P＜0.05说明用药后，瘤内血管数显著减少。这和预期的RNasin抗肿瘤的机理是一致的。RNasin是血管形成因子的抑制剂，可以抑制新血管的形成。当带瘤动物局部注射RNasin后，RNasin与肿瘤分泌的血管形成因子结合，抑制新血管的形成，从而抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核糖核酸酶抑制因子作为肿瘤生长抑制剂的制备，其采用人胎盘经破碎制成匀浆液，将上清液盐析后置于磷酸盐缓冲溶液中，用透析和ＤＥＡＥ离子交换层析提纯，其特征在于：上述过程均在４℃以下进行，再将提纯后的产物灭菌、分装即可得到比活为７００～８３０单位／毫克、蛋白浓度２．５０～３．０毫克／毫升的注射针剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：崔秀云，
申请(专利权)人：崔秀云，
类型：发明
国别省市：21[中国|辽宁]