使用核酸探针检测样品中的相关核苷酸序列制造技术

本发明专利技术涉及用于测定和检测样品中的核酸序列的方法。核酸可为ＲＮＡ或ＤＮＡ或两者。本发明专利技术也涉及用于测定样品中各种微生物的存在和物种的方法。也已鉴别革兰氏阴性（Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ）生物体的ｒＲＮＡ内的一组寡核苷酸核酸序列，其在以池的形式或组合使用于例如杂交检验中时有助于广泛鉴别作为一类的革兰氏阴性生物体。这组寡核苷酸可检测出指示这一大类革兰氏阴性生物体中的生物体存在的序列，同时显示几乎不会错误鉴别革兰氏阳性生物体和真菌或其它微生物。此检验包括至少一种相关核苷酸序列、至少一种核酸探针、氟表面活性剂和核酸酶同时培育。此检验可进一步用以通过使用其它的特异性探针来检测细菌、真菌或其它微生物的存在，或检测和／或鉴别样品中的标靶核酸序列。另外，本发明专利技术也涉及在结合检验中减少非特异性结合并促进复合物形成的方法。结合检验可为（但不限于）核酸杂交检验或免疫检验。本发明专利技术也涉及采用至少一种可为核苷酸序列的相关标靶、至少一种可为核酸探针的探针、和核酸酶的检测方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于测定和检测样品中相关的核酸序列的方法。核酸可为RNA或 DNA或两者。本专利技术也涉及用于测定样品中各种微生物的存在和物种的方法。也已鉴 别革兰氏阴性(Gram-negative)生物体的rRNA内的一组寡核苷酸核酸序列，其在以池的 形式或组合使用于例如杂交检验中时有助于广泛鉴别作为一类的革兰氏阴性生物体。这 组寡核苷酸可检测出指示这一大类革兰氏阴性生物体中的生物体存在的序列，同时显示 几乎不会错误鉴别革兰氏阳性生物体和真菌或其它微生物。此检验可进一步用以通过使 用其它的特异性探针来检测细菌、真菌或其它微生物的存在，以及检测和/或鉴别样品 中的标靶核酸序列。本专利技术也涉及一种检验，其包括至少一种相关核苷酸序列、至少一种以可检测 标记作标记的核酸探针、任选氟表面活性剂和核酸酶同时培育。此检验可进一步用以通 过使用其它的特异性探针来检测细菌、真菌或其它微生物以及裸核苷酸序列的存在，或 检测和/或鉴别样品中的标靶核酸序列。另外，本专利技术涉及在结合检验中减少非特异性 结合并促进复合物形成的方法。结合检验可为(但不限于)免疫检验、微流体检验、容 器钝化(passivation of vessels)、细胞培养或核酸杂交检验。本专利技术也涉及采用至少一种 可为核苷酸序列的相关标靶、至少一种探针(例如核酸探针)、和(限于)蛋白质、肽、 小化学分子、碳水化合物、脂多糖、多糖和脂质的检测方法。另外，本专利技术涉及用于进 行这些检验的试剂盒。
技术介绍
除病毒外，所有生命形式的每个细胞都含有核糖体，且因此都含有核糖体 RNA。核糖体含有三种独立的单股RNA分子，即大分子、中等大小的分子和小分子。 两种较大的rRNA分子在不同生物体中因大小而异。核糖体RNA为直接基因产物，且由 rRNA基因编码。此基因的DNA序列用作合成rRNA分子的模板。每个核糖体RNA亚 基都存在独立的基因。大部分生物体中存在多个rRNA基因，其中许多高等生物体含有 核和线粒体rRNA基因。植物和某些其它形式含有核、线粒体和叶绿体rRNA基因。为 简单起见，将此三种独立的rRNA基因都称为rRNA基因。所有生命形式的所有细胞中都存在大量核糖体。典型细胞中大约85% -90%的 总RNA为rRNA。例如大肠杆菌等细菌每个细胞约含有IO4个核糖体，而哺乳动物肝细 胞每个细胞约含有5X IO6个核糖体。因为每个核糖体都含有一个各rRNA亚基，所以细 菌细胞和哺乳动物细胞分别含有IO4和5 X IO6个各rRNA亚基。除核糖体RNA外，核糖核酸，特别是信使RNA，非常适用于测定来自RNA或 DNA病毒两者的活性病毒感染的身份、代谢或疾病状况、或存在。对转录鉴别、表达程 度或两者的测定可极大地有益于诊断学和生命科学研究以及各种质量控制检验。同样， 例如微RNA等其它形式RNA的测量可非常有益于诊断测定，特别是癌症。核酸杂交是所属领域中熟知的程序，其已用来特定地检测极少量或大量的特定 核酸序列，甚至在极大过量的非相关序列存在下。在涉及以下的公开案中发现许多现有 技术使用核酸杂交细胞和病毒的分子遗传学；细胞和病毒的基因表达；生命形式的遗 传分析；进化和分类或生物体和核酸序列；疾病过程的分子机制；和用于达到特定目的 的诊断方法，包括检测细胞和生物体中的病毒和细菌。可能得到最佳表征和最多研究的基因和基因产物为rRNA基因和rRNA。现有技 术包括遗传分析中使用rRNA和核糖体基因的杂交，以及生物体和核糖体基因序列的进化 和系统分类(taxonomic classification)。遗传分析包括例如测定各种生物体中核糖体RNA 基因的数目、细胞中存在的多种核糖体RNA基因之间的相似性、和细胞中rRNA合成的 速率和程度和其控制因子。进化和分类研究常常包含比较来自相关生物体和迥然不同的 生物体的rRNA基因碱基序列。已知核糖体RNA基因核苷酸序列在迥然不同的生物体中至少部分相似。举例 来说，大肠杆菌细菌核糖体RNA基因的DNA与来自植物、哺乳动物和多种细菌物种的 rRNA杂交。与这些其它物种杂交的大肠杆菌基因的分数随这些生物体的相关度而变。 实际上，所有rRNA基因序列都与来自密切相关的物种的rRNA杂交，但不太与来自关系 遥远的物种的rRNA杂交。通过利用对特定生物体组的rRNA具有特异性的探针检测这一组的灵敏度和简易 性会因大量以单股核酸分子形式存在于每个细胞中的两种rRNA分子而大大增强。然而， 虽然rRNA是单股分子，但其具有特别的高度旋绕的二级和三级结构，此可使探针进入某 些区段极其困难。甚至在溶解状态下变性也仅从rRNA重新形成这些二级和三级结构的 快速恢复趋势中得到部分缓解。此趋势快速发生，因为快速恢复是分子内的再折叠且不 受扩散限制。通过使RNA变性，且使用例如吸附至硝酸纤维素或其它载体上等技术或使 用熔融温度(Tm)比标靶区段的内部补体(internal complement)高的探针(此可阻止分子 自行退火)将RNA固定在变性状态，可解决此问题。此外，可使用对除rRNA以外的其它类别的细胞核酸具有特异性的rRNA探针， 通过核酸杂交特定地检测、鉴别和定量特定生物体或细胞组。举例来说，rRNA在细菌 大肠杆菌中以约6000个碱基长的前体分子形式合成。接着处理此前体分子，产生两种将 并入核糖体中的rRNA亚基(总计约4500个碱基)和一些将丢弃的额外RNA序列(总计 1500个碱基)。众所周知的扩增方法是聚合酶链式反应(PCR)。在PCR中，用特定的引物扩增 一条特有的相关特定核苷酸序列。如果引物发现其标靶位点，那么此遗传物质的序列将 迅速扩大百万倍。在PCR过程期间，所产生的DNA用作复制模板。此开始链式反应，其中DNA 模板以指数方式扩增。PCR可使一条DNA的单个或少数拷贝扩增若干数量级，产生所述 DNA条的百万个或更多拷贝。PCR可广泛修改以进行多种基因操作。几乎所有的PCR应用都采用一种耐热DNA聚合酶。一个实例为Taq聚合酶，其 是最初从细菌栖热水生菌(Thermus aqualicus)分离的酶。通过使用单股DNA作为模板、 和起始DNA合成所需的DNA寡核苷酸(也称为DNA引物)，此DNA聚合酶以酶的方式 从DNA构成组件(即核苷酸)组装新的DNA股。绝大多数PCR方法都使用热循环，即 交替加热和冷却PCR样品至一系列确定温阶。这些热循环步骤为在高温下通过DNA聚 合酶实体分离在较低温度下DNA合成期间用作模板的DNA双螺旋中的各股(DNA熔融) 以选择性地扩增标靶DNA所必需。PCR的选择性由与旨在在特定热循环条件下扩增的 DNA区互补的引物的使用产生。PCR反应通常由一系列20至40次重复温度改变(称为循环)组成。每个循环 通常由2-3个不连续温阶组成。最通常地，用具有三个温阶的循环进行PCR扩增。循 环之前常常为高温(> 90°C )下的单一温阶(称为保持)，且循环之后最终还有一个保持 供最终产物延伸或短暂存储用。每个循环中所用的温度和施加这些温度的持续时间视多 个参数而定。这些参数包括用于DNA合成的酶、反应中二价离子和dNTP的浓度、和引 物的熔融温度(Tm)。起始步骤由加热反应至约94-96°C的温度(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测样品中至少一种相关核苷酸序列的存在的方法，其包含：ａ）提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；ｂ）通过组合以下各物，产生混合物：ｉ）所述样品，ｉｉ）至少一种以可检测标记作标记的核酸探针，和ｉｉｉ）能够降解所述相关序列的核酸酶；其中所述核酸酶在所述探针加入之前或与之同时加入所述样品中；其中复合物在所述相关序列与所述探针之间形成；和ｃ）测量所述复合物中所述可检测标记的含量，其中所述复合物中存在所述可检测标记指示存在所述相关序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2008-1-24 61/023,348;US 2009-1-23 12/359,2631.一种检测样品中至少一种相关核苷酸序列的存在的方法，其包含a)提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；b)通过组合以下各物，产生混合物i)所述样品，ii)至少一种以可检测标记作标记的核酸探针，和iii)能够降解所述相关序列的核酸酶；其中所述核酸酶在所述探针加入之前或与之同时加入所述样品中； 其中复合物在所述相关序列与所述探针之间形成；和c)测量所述复合物中所述可检测标记的含量，其中所述复合物中存在所述可检测标 记指示存在所述相关序列。2.—种检测样品中至少一种相关核苷酸序列的存在的方法，其包含a)提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；b)通过组合以下各物，产生混合物i)所述样品，和ii)至少一种以可检测标记作标记的核酸探针与能够降解所述相关序列的核酸酶的组合；其中复合物在所述相关序列与所述探针之间形成；和c)测量所述复合物中所述可检测标记的含量，其中所述复合物中存在所述可检测标 记指示存在所述相关序列。3.—种检测样品中至少一种相关核苷酸序列的存在的方法，其包含a)提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；b)通过组合以下各物，产生混合物i)所述样品，ii)至少一种以可检测标记作标记的核酸探针，和iii)能够降解所述相关序列的核酸酶；其中所述探针在选定时期内加入所述样品中； 其中复合物在所述相关序列与所述探针之间形成；和c)测量所述复合物中所述可检测标记的含量，其中所述复合物中存在所述可检测标 记指示存在所述相关序列。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述选定时期为所述核酸酶加入之后的约0至约 15分钟。5.—种检测样品中至少一种相关核苷酸序列的存在的方法，其包含a)提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；b)通过组合以下各物，产生混合物i)所述样品，ii)至少一种以可检测标记作标记的核酸探针，和iii)能够降解所述相关序列的核酸酶；其中所述核酸酶在所述相关序列与所述探针杂交之前加入所述样品与所述探针中， 产生选定杂交百分比；其中复合物在所述相关序列与所述探针之间形成；和C)测量所述复合物中所述可检测标记的含量，其中所述复合物中存在所述可检测标 记指示存在所述相关序列。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述选定杂交百分比为约5%至约95%。7.—种检测样品中至少一种相关核苷酸序列的存在的方法，其包含a)提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；b)通过组合以下各物，产生混合物i)所述样品，ii)至少一种以可检测标记作标记的核酸探针，和iii)能够降解所述相关序列的核酸酶；和iv)至少一种氟表面活性剂；其中复合物在所述相关序列与所述探针之间形成；和c)测量所述复合物中所述可检测标记的含量，其中所述复合物中存在所述可检测标 记指示存在所述相关序列。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述氟表面活性剂是选自阴离子型氟表面活性 剂、阳离子型氟表面活性剂、两性氟表面活性剂、非离子型氟表面活性剂、两性离子型 氟表面活性剂和其混合物的群组。9.根据权利要求1、2、3或5中任一权利要求所述的方法，其另外包含将至少一种氟 表面活性剂加入所述混合物中。10.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种氟表面活性剂是选自由阴离子型 氟表面活性剂、阳离子型氟表...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃利奥特P道森，史蒂文J西蒙斯，洛里J鲍科姆，珍妮弗M贝克，克里斯提E旺布尔，朱迪丝马登，苏布拉马尼塞拉帕恩，安德鲁赫恩，萨尔塞米纳拉，
申请(专利权)人：生物风险公司，塞尔西斯国际公司，
类型：发明
国别省市：US