本发明专利技术提供了一种肿瘤细胞中靶向性表达ｓｈＲＮＡ的真核表达载体，包括如下结构：１）由ｐｏｌＩＩ型启动子驱动的、将荧光蛋白基因与ｍｉｒｓｈＲＮＡ结构串联在一起的表达框结构；２）经过ＣＭＶ增强子和ＳＶ４０增强子增强的ｈＴＥＲＴ启动子；３）以ｍｉｒ３０为基础的ｍｉｒｓｈＲＮＡ结构：ｍｉｒ３０左臂－ｓｈＲＮＡ－ｍｉｒ３０右臂，此ｍｉｒｓｈＲＮＡ结构可多个串联；４）Ｋａｎ或者Ａｍｐ抗性筛选标记；５）ＬＲ同源重组臂。利用本发明专利技术提供的方法构建上述ｓｈＲＮＡ真核表达载体，能够在肿瘤细胞中靶向性、特异性地表达单条或多条ｓｈＲＮＡ，在对肿瘤细胞进行ＲＮＡ干扰、实行基因治疗的同时，又不影响正常细胞，解决了利用ＲＮＡ干扰进行基因治疗时的非特异性干扰难题，有助于ＲＮＡ干扰在肿瘤的基因治疗方面的研究和应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种能够在肿瘤细胞中靶向性表达单条或多条shRNA的真核表达载 体及其构建。
技术介绍
RNA干扰(RNA interference)是一种由双链RNA诱发的基因沉默(gene silelencing)。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA (mRNA)被降解，从而抑制了 该基因的表达。RNA干扰技术在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景。科 学界普遍认为，通过利用RNAi，操纵细胞的核糖核酸(遗传信使)，干扰或压制目标基因，以 防止那些会导致疾病的蛋白质形成，有可能产生出前景不错的治疗药物，用于治疗包括癌 症、失明和艾滋病在内的疾病。目前，人们已经成功地使用发夹状RNA或以质粒DNA或病毒为载体在细胞内生成 小干扰RNA样转录物，来特异性地抑制外源性或内源性基因在哺乳类动物或人细胞内的表 达。用质粒DNA或病毒为载体可在细胞内长时间、稳定地生成小干扰RNA。此类研究将有助 于把RNA干扰技术用于治疗人类疾病。现阶段，大多数shRNA真核表达载体所采用的shRNA表达框结构，均为polIII型 启动子(如hU6)+shRNA+终止信号形式的结构。这种结构，优点在于广谱表达，精确终止； 但是由于用的是TO等polIII型启动子，所以表达效率不高，产生的shRNA的数量一般，而 且容易照成非特异性干扰，在对肿瘤细胞等目的细胞进行RNA干扰的同时，也会对其它正 常细胞造成影响。上述问题在一定程度上限制了 RNA干扰技术在基因治疗方面的应用。随着对小分子RNA中的microRNA的研究，科学家们发现，microRNA有三种形式 带有原始双臂的pri-microRNA ；去掉双臂的pre-microRNA ；成熟的microRNA。研究显示， microRNA的原始双臂对microRNA的剪切、成熟microRNA的形成至关重要，而且，在保留双 臂结构的前提下，将中间的原始microRNA序列换成其它的shRNA序列，整个结构依然可以 被生物体内的相关酶类识别和剪切，从而形成成熟形式的siRNA。利用上述原理，研究者们开发设计了 mirshRNA形式的shRNA表达框结构，即polII 型启动子(如CMV启动子)+microRNA左臂+shRNA+microRNA右臂+PolyA形式的结构。为 了观测方便，一般会在polll型启动子之后紧跟一个荧光蛋白基因。这种mirshRNA形式的shRNA表达框结构，优点很多(1)由于采用了 CMV启动子等高效的polll型启动子，使得shRNA的产量更多。(2)由于采用了 microRNA的双臂，使得shRNA的剪切效率更高，能够生成更多的 siRNA,同时，siRNA的干扰效率也有一定提升。(3)由于荧光蛋白基因与ShRNA表达结构紧密连接在一起，所以观测到的荧光强 度，能够直接反映shRNA的表达量。(4)polII型启动子可以换成其它组织特异型启动子，以达到在特定细胞或组织特 异性表达shRNA的目的。另一方面，治疗性shRNA的靶向性表达决定了利用RNA干扰进行基因治疗能否成 功，尤其是对肿瘤的基因治疗。如何使shRNA只在肿瘤细胞中表达，最大限度的杀伤肿瘤细 胞而保护正常组织，即靶向性问题是基因治疗从基础研究推向临床治疗必须克服的诸多问题之一。近年研究发现，端粒酶在90%以上的肿瘤细胞中高表达，而在正常的体细胞中 不表达。人端粒酶有3种组分已被鉴定，即RNA模板、端粒酶相关蛋白、端粒酶逆转录酶 (humantelomerase reverse transcriptase，hTERT)。 hTERT 是端粒醇的限速醇，hTERT 活 性调控主要发生在其转录水平，hTERT基因在肿瘤细胞中是高度激活的，而在大多数正常细 胞中是被抑制的，所以hTERT启动子可用于肿瘤细胞中特异性shRNA表达。目前，已有研究者将hTERT启动子应用于RNA干扰研究中，但都是直接在hTERT启 动子后面连接一个shRNA序列。这种shRNA表达结构，虽然可以做到在肿瘤细胞中特异性 表达shRNA，但是由于采用的是polII型启动子+shRNA的结构，无法像TO等polIII型启动 子一样精确终止，所以shRNA的表达和剪切都会受到一定影响，从而降低siRNA的产量。此外，由于hTERT启动子缺乏TATA盒，所以其对下游基因或shRNA的表达调控能 力比CMV等强启动子要弱，所以，通过各种修饰，增加一些其它功能元件，以增强hTERT启动 子的活性，是hTERT启动子研究和应用中的一个重点。
技术实现思路
为克服上述shRNA在肿瘤细胞中表达的种种缺陷，增强hTERT启动子的活性，达到 在肿瘤细胞中靶向性、特异性地表达单条或多条shRNA的目的，本专利技术提供了一种技术方 案为肿瘤细胞中靶向性表达shRNA的真核表达载体，包括polll型启动子、荧光蛋白基因、 mirshRNA结构和Poly A串联的表达框结构，将polll型启动子、荧光蛋白基因、mirshRNA结 构和PolyA串联的表达框结构构建至同一个载体上；所述polll型启动子为上游具有CMV 增强子和SV40增强子的hTERT启动子；所述mirshRNA结构为microRNA左臂+待表达的 shRNA+microRNA右臂；所述荧光蛋白基因位于hTERT启动子下游、mirshRNA结构上游。上述荧光蛋白基因为绿色荧光蛋白基因(EGFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)或黄色 荧光蛋白基因(YFP)。所述表达框中可插入一个shRNA，或者串联一个以上的mirshRNA结构；所述 mirshRNA结构以mir30为基础构建，采用mir30的双臂，在mir30左臂和mir30右臂之间插 入相同或不同的shRNA。所述表达框两侧有一对LR同源重组臂；所述载体还包括Kan或者Amp抗性筛选标记。根据上述技术方案，本专利技术还提供了一个真核表达载体，序列如SEQ NO 1所示。本专利技术技术方案中表达框结构中的hTERT启动子，由于得到了 CMV增强子 和SV40增强子的增强，其活性得到了极大的提高；采用了“加强后的hTERT启动子 +mirshRNA+PolyA”形式的结构，与“polIII型启动子(如U6启动子)+shRNA”或者“polII 型启动子(如hTERT启动子)+shRNA”等结构相比，shRNA的表达量大大增加，且其剪切效 率大幅提高，从而极大地提升了 siRNA的产量；由于将荧光蛋白基因和mirshRNA结构连接 在一起，且共同置于hTERT启动子下游，一方面能够通过观察荧光，监测质粒转染细胞时的转染效率；另一方面，也能够通过观察荧光强度，非常直观地判断hTERT启动子的活性以及 shRNA的表达量。另外，为了扩大应用范围，本专利技术还在hTERT启动子-荧光蛋白基 因-mirshRNA-PolyA结构两侧插入了 LR同源重组臂，一方面能够将此载体作为普通的 shRNA真核表达载体使用，另一方面，亦可以在必要时将其作为腺病毒包装系统中的穿梭载 体，利用Invitrogen公司的BLOCK-iT Adenoviral System包装腺病毒，从而更好地进行 RNA干扰研究或应用。本专利技术还提供了一种技本文档来自技高网...
【技术保护点】
肿瘤细胞中靶向性表达ｓｈＲＮＡ的真核表达载体，包括ｐｏｌＩＩ型启动子、荧光蛋白基因、ｍｉｒｓｈＲＮＡ结构和Ｐｏｌｙ Ａ串联的表达框结构，其特征在于将ｐｏｌＩＩ型启动子、荧光蛋白基因、ｍｉｒｓｈＲＮＡ结构和ＰｏｌｙＡ串联的表达框结构构建至同一个载体上；所述ｐｏｌＩＩ型启动子为上游具有ＣＭＶ增强子和ＳＶ４０增强子的ｈＴＥＲＴ启动子；所述ｍｉｒｓｈＲＮＡ结构为：ｍｉｃｒｏＲＮＡ左臂＋待表达的ｓｈＲＮＡ＋ｍｉｃｒｏＲＮＡ右臂；所述荧光蛋白基因位于ｈＴＥＲＴ启动子下游、ｍｉｒｓｈＲＮＡ结构上游
【技术特征摘要】
肿瘤细胞中靶向性表达shRNA的真核表达载体，包括polII型启动子、荧光蛋白基因、mirshRNA结构和Poly A串联的表达框结构，其特征在于将polII型启动子、荧光蛋白基因、mirshRNA结构和PolyA串联的表达框结构构建至同一个载体上；所述polII型启动子为上游具有CMV增强子和SV40增强子的hTERT启动子；所述mirshRNA结构为microRNA左臂+待表达的shRNA+microRNA右臂；所述荧光蛋白基因位于hTERT启动子下游、mirshRNA结构上游。2.根据权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于，所述荧光蛋白基因为绿色荧光 蛋白基因(EGFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)或黄色荧光蛋白基因(YFP)。3.根据权利要求1所述的真核...
【专利技术属性】
技术研发人员：易银沙，吕媛，孙永林，袁炳秋，
申请(专利权)人：长沙赢润生物技术有限公司，易银沙，吕媛，孙永林，袁炳秋，
类型：发明
国别省市：43
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