用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法技术

提供了用于快速且灵敏地检测样品中的碳青霉烯酶的组合物和方法。所述组合物包括新型引物和探针组合物，其用于检测样品中这种酶的存在情况，特别是通过使用ＰＣＲ方法。这些引物和探针组可以在扩增方法（例如，ＰＣＲ，特别是定量ＰＣＲ）中使用，并且包装到试剂盒中以用于在扩增方法中使用，以便为了检测测试样品，特别是患者样品，特别是直接样品中的碳青霉烯酶。因此，在一个实施方案中，本发明专利技术提供了ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１、２、４、５、７、８、１４、１５、１７、１８和２０中所示的新型寡核苷酸引物，以及ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、６、９、１６和１９中所示的新型寡核苷酸探针序列。这些序列可以在用于检测样品中的碳青霉烯酶的方法中使用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于快速鉴定赋予抗生素抗性的克雷伯氏菌属(J/e^/e/h)细菌的碳青霉烯酶基因的组合物和方法。
技术介绍
肠杆菌科(Enterobacteriaceae )是一个大型的细菌科，包括较 熟悉的病原体中的许多，例如沙门氏菌属(5^7顶o/2e/)细菌和大肠 杆菌(f力eWc力/a co7/)。属于肠杆菌科的属的成员已获得了这样 的名声，即将它们置于临床微生物学中最致病和最常遇到的生物之中。这些大的革兰氏阴性杆菌常常与肠道感染相关，但可以在几乎所有的 天然生境中发现。这个科的许多成员是在人和其他动物的肠中发现的 肠道微生物区系的正常部分，而其他成员在水或土壤中发现，或者是 在各种不同动物和植物上的寄生物。大肠杆菌是最重要的模式生物之一，并且它的遗传学和生物化学已得到了仔细研究。肺炎克雷伯氏菌(i7e^/ea p/ 函面.se)是在口 、皮肤和肠的 正常微生物区系中发现的革兰氏阴性的、不动的、有荚膜的、发酵乳 糖的、兼性厌氧的细菌。它是肠杆菌科的克雷伯氏菌属的临床上最重 要的成员。肺炎克雷伯氏菌可以引起细菌性肺炎，尽管它更通常地牵 涉医院内泌尿道和伤口感染，特别是在无免疫应答的个体中。对于老 年人中的泌尿道感染，克雷伯氏菌属的排位仅次于大肠杆菌。对于具 有慢性肺病、肠致病性、鼻粘膜萎缩和鼻硬结症的患者，它还是机会 致病菌。粪便是患者感染的最重要的来源，随后为与被污染的器具接 触。随着抗生素抗性菌抹持续出现，肺炎克雷伯氏菌日益成为医院感染。克雷伯氏菌属细菌具有染色体A类p-内酰胺酶，该酶给予其对于氨苄青霉素的固有抗性。许多菌林已获得了超广谱P-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamase, ESBL )， 其具有另夕卜的对于羧苄青霉素、氨苄青霉素、喹诺酮类的抗性，以及逐渐增加的对于头孢他啶的抗性。碳青霉烯抗生素已成为用于对付革兰氏阴性感染的重要试剂，特别是当革兰氏阴性感染由不同的医院病原体引起时。碳青霉烯类具有任何P -内酰胺抗生素的最广泛的活性谱，并且通常是用于在由多重抗性革兰氏阴性细菌引起的感染的治疗中使用的最合适的试剂。碳青霉烯类被认为是被选择用于治疗由于具有超广镨(3 -内酰胺酶(ESBL)的肠杆菌科细菌而引起的感染的试剂。产生ESBL的肺炎克雷伯氏菌的流行已在美国出现，并且在某些地区中接近分离物的50°/。。当遇到这样高比率的产生ESBL的生物时，碳青霉烯类成为日益重要的治疗选择。在过去数年中，已在某些地区中观察到抗碳青霉烯的革兰氏阴性菌的逐渐增加。在美国，碳青霉烯抗性在很大程度上归于在鲍氏不动杆菌(Jc//7o^er 6a謹脂7)、铜绿假单胞菌(户secTo/z70/2as aerw^7j70W )和罕见地肺炎克雷伯氏菌的分离物中C类头孢菌素酶的表达和外膜孔蛋白的丧失。罕见地在肺炎克雷伯氏菌中回收到了水解碳青霉烯的P-内酰胺酶(碳青霉烯酶)。然而，最近在美国东北部鉴定了具有碳青霉烯酶KPC-1 、 KPC-2和KPC-3的分离物。这些分离物通常对于多种抗生素类别具有抗性，从而给临床医生呈现了非常有限的治疗选择。引起感染暴发的高抗性生物的出现是微生物学和传染病界已研究了数年的重大问题。目前，可以将碳青霉烯抗性肺炎克雷伯氏菌的出现添加至正在增长的高抗性生物列表中。2005年在纽约市的多个医院中发生的碳青霉烯抗性肺炎克雷伯氏菌感染的爆发将广泛的关注带至这些生物。KPC酶是介导对于超广镨头孢菌素类的抗性以及对于碳青霉烯类的抗性的P -内酰胺酶。2001年在North Carolina首次才艮道了这些碳7青霉烯酶，但目前已在美国各个部分中分离出了它们，最经常地在东 海岸。产生碳青霉烯酶的分离物的检测对于疗法的更好管理和对于感 染控制是重要的。专利技术概述提供了用于快速且灵敏地检测赋予抗生素抗性的碳青霉烯酶基因 的组合物和方法。所述组合物包含用于检测样品中该基因的存在情况 的寡核苷酸新型引物和探针组。这些引物和探针组可以在扩增方法(例如PCR，特别是定量PCR)中使用，并且包装到试剂盒中以用于在扩增 方法中使用，以便为了检测测试样品，特别是患者样品中碳青霉烯酶 基因的存在情况，由此检测到该基因表明所述样品包含对于碳青霉烯 类具有抗性的细菌。因此，在一个实施方案中，本专利技术提供了 SEQ ID NO: 1、 2、 4、 5、 7、 8、 14、 15、 17、 18和20中所示的新型寡核苷酸引物，以及SEQ ID NO: 3、 6、 9、 16和19中所示的新型寡核苷酸探针序列。这些序 列可以在用于检测样品中的碳青霉烯酶基因的方法中使用，所述碳青 霉烯酶基因的存在表明所述样品包含具有碳青霉烯抗性的细菌。进一步提供了可用于检测样品中的碳青霉烯酶基因的试剂盒，其 中所述试剂盒包含根据本专利技术的组合物。所述试剂盒可以进一步包含 关于在基于聚合酶的扩增反应(例如，PCR或QPCR)中使用所提供的 组合物的指导说明书。在另一个实施方案中，本专利技术涉及通过使用在该细菌中存在的靶 核酸区域的基于聚合酶的扩增，来检测样品中的碳青霉烯酶的方法， 所述方法包括(a)提供怀疑包含具有碳青霉烯抗性的肠细菌的测试 样品，(b)在足以提供基于聚合酶的核酸扩增产物(其包含编码碳青 霉烯酶的核苷酸序列的靶核酸区域)的条件下，使所述样品与本专利技术 的组合物接触；和(c)检测所述核酸扩增产物的存在情况，作为测试 样品中碳青霉烯酶的存在情况的指示。在各种实施方案中，所述测试样品是直接样品，并且本专利技术的方法和组合物能够在这样的细菌浓度 下检测该直接样品中碳青霉烯酶的存在情况，所述细菌浓度处于在从 被那种细菌感染的受试者中收集的样品中通常发现的细菌负荷范围之 内。本专利技术还涉及根据本专利技术的引物的用途，其中所述引物或探针具有根据在SEQ ID NO: 1-9和14-20和14-20中所定义的序列中任一序 列的序列。附图筒述附图说明图1:关于标准PCR的灵敏度实验。还将相同的DNA稀释方案(20 ng至2fg)用于标准PCR引物。可靠的阳性判读(call)基于在所有 3个重复内可靠地检测出条带的能力。使用这个标准，对于标准PCR 引物而言可靠的阳性是32 pg，并因此灵敏度是32 pg (l，OOO个基因 组等价物)。图2:关于标准PCR的直接样品实验。还将从尿和血液样品中提 取的DNA用于接种标准PCR反应。在这个凝胶中未展示的是尿阴性对 照样品，其在分开的凝胶上走样并且不包含任何条带。除了阳性模板 对照(positive template control, PTC)夕卜，没有样品产生条带。专利技术详述 / 舰本文提供了用于检测在怀疑具有产生碳青霉烯酶的细菌的样品中 碳青霉烯酶的存在情况的新型方法和组合物。由于有时低水平的酶表达或不易与其他抗性机制(例如，不渗性或靶修饰)相区分，当使用 常规易感性测试方法时，就碳青霉烯酶产生来筛选分离物是困难的。 用于检测/鉴定碳青霉烯酶的某些表型方法已在文献中进行了描述，但 它们通常不是标准化的，并且由于所需的专业水平和/或专门设备，有些对于常规临床实验室测试来说是不可行的。科学委员会(例如CLSI )目前未给出关于用于碳青霉烯酶检测的方法的推荐。因此，对于用于篩选包含本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定包含碳青霉烯酶的细菌的分离的核酸分子，所述核酸分子选自ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１－９和１４－２０。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-4-6 60/910,5351.用于鉴定包含碳青霉烯酶的细菌的分离的核酸分子，所述核酸分子选自SEQ ID NO1-9和14-20。2. 权利要求1的核酸分子，其中所述分子可在PCR反应中用作引物。3. 权利要求2的核酸分子，其中所述分子是选自SEQ ID NO: 1、 2、 4、 5、 7、 8、 14、 15、 17、 18和20的核酸分子。4. 权利要求l的核酸分子，其中所述分子可用作探针。5. 权利要求4的核酸分子，其中所述分子是选自SEQ ID NO: 3、 6、 9、 16和19的核酸分子。6. 对于碳青霉烯酶特异的PCR引物组，所述引物组包含具有SEQ ID NO: l和SEQ ID NO: 2， SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5， SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8， SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 和SEQ ID NO: 15， SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 8，或者SEQ ID NO: 17和18中所示的序列的寡核苷酸对，其中所述引物在用于检测样品中 包含碳青霉烯酶的细菌的存在情况的PCR测定法中是有效的。7. 通过使用在编码碳青霉烯酶的核苷酸序列中存在的靶核酸区域的基于聚合酶的扩增，来检测样品中具有碳青霉烯抗性的细菌的存在情 况的方法，所述方法包括a) 提供怀疑包含所述碳青霉烯抗性细菌的测试样品；b) 在足以提供包含所述靼核酸区域的基于聚合酶的核酸扩增产物 的条件下，使所述样品与至少第一和第二寡核苷酸引物接触，其中所述 至少第一和第二寡核苷酸引物选自i) 包含SEQ ID NO: 1的第 一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO: 2的第二寡核苷酸引物；ii) 包含SEQ ID NO: 4的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO: 5的第二寡核苷酸引物；iii )包含SEQ ID NO: 7的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO:8的第二寡核苷酸引物；iv )包含SEQ ID NO: 14的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO: 2的第二寡核苷酸引物；v)包含SEQ ID NO: 4的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO: 15的第二寡核苷酸引物；vi )包含SEQ ID NO: 20的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO: 8的第二寡核苷酸引物；vii)包含SEQ ID NO: 17的第一寡核普酸引物和包含SEQ ID NO: 18的第二寡核苷酸引物；和 c)检测扩增出的产物。8. 权利要求7的方法，其中所述样品是直接样品。9. 权利要求7的方法，其中所述基于聚合酶的核酸扩增是实时定 量扩增。10. 用于检测来自患者的样品中包含碳青霉烯酶的细菌的存在情 况的方法，所述方法包>^:(a) 提供来自所述患者的样品；(b) 从所述样品中分离和纯化出核酸；(c) 形成聚合酶链式反应溶液，其包含来自步骤(b)的核酸的至 少部分、核苷三磷酸单体的混合物、緩沖溶液中的酶Taq聚合酶、和PCR 引物组，所述PCR引物组选自i) 包含SEQ ID NO: 1的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO: 2的第二寡核苷酸引物；ii) 包含SEQ ID NO: 4的第 一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO: 5的第二寡核苷酸引物；Hi )包含SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：CC怀特福特，C于，
申请(专利权)人：贝克顿迪金森公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]