一种完全降解赤霉烯酮的微杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，具体为一种完全降解赤霉烯酮的微杆菌及其应用。本发明专利技术发现一株微杆菌可以降解赤霉烯酮，命名为Microbacteriumsp. FY1538。该微杆菌属于微杆菌属（Microbacterium sp.），分离自青藏高原青海湖边的草皮（N36.34.243E100.32.285）。Microbacteriumsp. FY1538在LB培养基中培养，添加终浓度10ul/ml的甲醇，培养基pH7.4，培养温度30℃，摇瓶震荡培养48h，转速220rpm，发酵上清液具有完全降解赤霉烯酮的能力。本发明专利技术提供的微杆菌可应用于玉米等发霉农作物的脱毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物
，具体涉及一种微杆菌及其完全降解赤霉烯酮的应用。
技术介绍
赤霉烯酮(zearalenone，ZEN),又称为F_2毒素，是一种具有类雌激素生物活性的霉菌毒素，主要是由镰刀属)真菌的某些种，如禾谷镰刀菌{Fusariumgraminearum)等通过聚酮类合成代谢途径生成。能导致人或动物的生殖系统紊乱，临床表现为雌激素过多症，还有潜在致癌性与肝肾损伤能力。镰刀菌生态适应性强，既营寄生又营腐生生活，分布广泛。赤霉烯酮物化性质稳定，不溶于水，难于清除。农作物生长、收获和储存、加工等多个环节中，都极易被镰刀菌侵害而污染赤霉烯酮。近些年全球各地越来越多地在谷物(如玉米等)中检测出赤霉烯酮，严重威胁着食用者的健康安全和养殖业的饲料安全。微杆菌属577.)是一种在土壤中广泛分布的常见革兰氏阳性菌，不生孢，不抗酸。不运动或以I?3根鞭毛运动。好氧，弱厌氧。在酵母膏-蛋白胨-葡萄糖琼脂上菌落不透明，有光泽，黄色。化能异养菌，以呼吸代谢为主，也可能弱发酵产酸。营养要求复杂。最适生长温度30°C。已报道微杆菌属菌株可以降解黄原胶、壳聚糖、氯乙酰及多种含苯环化合物，目前尚无关于降解赤霉烯酮的微杆菌属菌株的报道。本专利技术从青藏高原青海湖边的草皮(N36.34.243 E100.32.285)中筛选到一株具有赤霉稀酮降解能力的微杆菌属菌株，命名为577.FY1538，菌株保藏号为:CGMCC N0.10614，其发酵上清液可以完全降解赤霉烯酮。该菌可应用于玉米等发霉谷物的脱毒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株可以降解赤霉烯酮的微杆菌属的菌株Microbacteriutn sp.FYl538，以及其应用。本专利技术提供的微杆菌属的菌株，是从青藏高原青海湖边的草皮(N36.34.243E100.32.285)中分离获得，该菌种保藏号为CGMCC N0.10614，保藏日期为2015年3月11号，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研宄所。对该菌株的16S rDNA (SEQ ID NO 1)，表明该菌株来源于细菌中的微杆菌属，命名577.FY1538。其16S rDNA序列与 Microbacterium paraoxydans>Microbacterium菌种相似度均为 97%。该菌株在LB平板上生长的菌落为圆形，培养36h后直径大约1.5mm，不透明，有光泽，黄色(见图1)，革兰氏染色及显微镜观察，该菌株为革兰氏阳性菌(见图2 )。本专利技术还提供利用Microbacterium寧FY1538菌株培养液上清完全降解赤霉稀酮的方法。具体步骤为:将所述菌株培养在LB液体培养基中(LB培养基的组成为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.4，水溶液)；添加终浓度5-15 μ I/ml的甲醇(优选终浓度10-12 μ I/ml);培养温度为25-35°C，震荡或者搅拌培养，转速为100-800rpm，培养时间为24-72小时(优选培养时间为48-60小时)；对Microbacterium sp.FY1538的培养液，通过离心或者过滤的方法去除菌体，获得培养液上清溶液；将该培养液上清在30-50°C条件下，与赤霉烯酮经过20-24小时的反应。用TLC方法分析反应体系中赤霉烯酮的残留，用HPLC的方法分析赤霉烯酮的降解，表明赤霉烯酮已完全降解(图3，图4)。本专利技术提供的菌株#/(^0如<^6?/^仰？ 5/7.FY1538可应用于玉米等发霉谷物的脱毒。【附图说明】图1.Microbacterium sp.FY1538菌落形态图。该菌株在LB平板上菌落为圆形较小，不透明，有光泽，黄色。该菌落形态的特征与微杆菌属细菌形态特征相符合。图2.Microbacterium sp.FY1538细胞经过革兰氏染色后在显微镜下的形态。与革兰氏阳性菌特征吻合。图3.TLC方法分析赤霉稀酮的降解。Mi crobac teri um sp.FYl 538在含有甲醇的LB培养基中的培养48小时后，取发酵液上清与赤霉烯酮在30°C条件下反应24小时后，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯蒸干并用少量乙醇溶解，用TLC方法分析反应体系中赤霉烯酮的残留。TLC的展开剂为石油醚:丙酮:乙酸乙醋=5:4:1。泳道1-,Microbacterium sp.FY1538菌株在含甲醇的LB中培养2天后的培养液上清；泳道2:赤霉烯酮标准样；泳道3:Microbacterium sp.FY1538在加甲醇的LB中培养2天后的培养液上清与赤霉稀酮反应24小时。图4:HPLC的方法分析赤霉稀酮的降解。Microbacterium sp.FY1538培养液上清与赤霉烯酮在30°C条件下反应O小时、I小时，3小时、6小时和20小时后，用HPLC(Agilent Eclipse Plus C18)分析反应体系中赤霉稀酮的残留。HPLC流动相为甲醇和水，甲醇5%-100%梯度洗脱30min，紫外检测波长240nm。蓝色:0小时；红色:催化反应I小时；绿色:催化反应3小时；粉色:催化反应6小时；黄色:催化反应20小时。【具体实施方式】所用实验材料和相关操作方法如下，未详述处可以参考冷泉实验室的《分子克隆》(J.Sambrook, et al.,第二版，1996): 1.培养基 LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，其余为水，pH 7.4。2.实验试剂:甲醇、乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、环戊酮，各种无机盐类购于国药集团化学试剂(沪试)，分析纯；赤霉烯酮购于Sigma公司(货号Z2125);引物合成和DNA测序由上海杰李生物技术有限公司完成。TLC展开剂用石油醚:丙酮:乙酸乙酯=5:4:1配制而成，现用现配。3.TLC的分析方法:用sp.FY1538降解赤霉稀酮的方法:将Mi crobac teri um sp.FY1538接种于50 mL LB培养基中，添加终浓度10 μ Ι/ml的甲醇，30°C，震荡培养48 h ;取发酵液12000印111离心，其上清，每500 ^1加入25^8赤霉烯酮，在30°C水浴反应24h后，用适量乙酸乙酯萃取反应液，收集乙酸乙酯蒸干并用少量乙醇溶解析出物，用TLC方法(MERCK公司TLC硅胶板60F254，展开剂为石油醚:丙酮:乙酸乙酯=5:4:I)检验赤霉稀酬残留。4.HPLC 的分析方法:将 #icro如Cieriws sp.FY1538 接种于 50 mL LB 培养基中，添加终浓度10 μ I/ml的甲醇，30 °C，震荡培养48 h ;发酵液12000rpm离心，上清液每500 μ I加入25 μ g赤霉烯酮，在30°C水浴反应不同时间，用HPLC进行分析。HPLC层析柱为Agilent Eclipse Plus C18，流动相为甲醇和水，甲醇5%_100%梯度洗脱30min，紫外检测波长240nmo实施例1:赤霉烯酮降解菌株的筛选分离与鉴定 土壤样品采自青藏高原青海湖边的草皮(N36.34.243 E100.32.285)。取2 g 土样，加AlO mL 0.15本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株微杆菌属菌株，能够完全降解赤霉烯酮，命名为Microbacteriumsp. FY1538，菌种保藏号为CGMCC NO. 10614。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吕红，徐天宇，周峻岗，余垚，胡苏莹，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31