用于治疗Ａ型血友病患者的去甘露糖基化的重组因子Ⅷ制造技术

本发明专利技术的实践提供了去甘露糖基化的因子ＶＩＩＩ，该因子ＶＩＩＩ在人体中的免疫原性基本降低或消失。所述修饰的因子ＶＩＩＩ与至少包括一个取代改变的修饰的氨基酸序列一起被公开。所述修饰的因子ＶＩＩＩ用于血友病，用来避免或预防抑制因子抗ＦＶＩＩＩ抗体的作用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及基本上无免疫原性的或具有低免疫原性的修饰的因子VIII (FVIII)。 本专利技术还涉及包括编码所述修饰的FVIII的DNA的核酸构建体，以及涉及在宿主细胞或 生物体中表达和产生所述修饰的FVIII的方法。本专利技术还涉及向受试者给药所述修饰的 FVIII以治疗出血失调的方法。
技术介绍
人因子VIII =C(FVIII)是凝固因子，在X染色体连锁的出血失调的A型血友病中 缺失FVIII，这是患病男性出血性发病和死亡的主要原因。通常，以输入全血来治疗血友病 患者。最近，以衍生自人血浆的FVIII浓缩物制剂来治疗。然而，使用血浆衍生的产品易使 血友病患者暴露于可能患病毒传播的疾病(例如肝炎和AIDS)的风险中。用来减少此种风 险的昂贵的纯化方案增加了治疗成本。由于血浆衍生的FVIII的成本增加和供应限制，使 患者只能依请求而进行短暂地治疗，而不能进行预防性治疗。重组产生的FVIII在纯度和 安全性方面比血浆衍生的FVIII具有本质上的优点，而且增加了可用性，因此，许多研究的 努力方向集中于重组产生的FVIII的开发。由于FVIII的不稳定性质(尤其在激活以后)， 不论血浆衍生的还是重组产生的FVIII都必需以大量和重复的蛋白剂量施用，以实现治疗 的有利效果。然而，患者给药的FVIII蛋白的量与抑制它的活性的抗体的发生相关联。根 据此种已知的免疫原性，开发用作治疗试剂的新的重组形式的FVIII的一个目的是开发减 少或消除此种免疫应答的产品。在血液凝固的内在途径中，FVIII作为辅助因子起作用，以 通过因子IXa来促进因子X的激活，这一反应在钙离子的存在下发生在带负电荷的磷脂表 面上。所述FVIII分子分为6个结构域3个A结构域(Al、A2、A3)、1个富含糖类的非 必须中心结构域(B结构域)、以及2个C结构域(Cl、C2)(见图5)。FVIII以异型二聚体 的形式被分泌到血浆中，该异型二聚体包括重链(A1-A2-B结构域)和轻链(A3-C1-C2结构 域)，该重链和轻链通过Al结构域和A3结构域之间的非共价二价金属离子键合而连接。在 血浆中，通过结合冯维勒布兰德(von ffillebrand)因子而使FVIII稳定。更具体地，所述 FVIII的轻链以非共价相互作用结合于冯维勒布兰德因子氨基末端的初级结合位点。通过 凝血酶的蛋白水解激活，FVIII被激活成为2个重链片段(50kDa的片段Al和43kDa的片段 A2)和轻链(73kDa的链A3-C1-C2)的异型三聚体。因此，FVIII的激活形式(FVIIIa)由Al 亚基和游离的A2亚基组成，所述Al亚基通过二价金属离子键合与凝血酶切割的A3-C1-C2 轻链相连接，所述游离的A2亚基通过离子缔合(ion association)与所述Al结构域相连 接。所述FVIIIa异型三聚体是不稳定的，通过在生理条件下A2亚基的解离而迅速失活。 所述FVIII分子包括25个能够进行N-连接的糖基化的共有序列(consensus sequences) (Asn-Xxx-Thr/Ser)，其中的20个共有序列已经被糖基化(1)。FVIII蛋白可以被功能性的定义为能够补充衍生自患A型血友病患者的血浆中的 凝固缺陷的因子。为了进行A型血友病的治疗，从人类或猪的血浆中纯化了 FVIII，并且最近通过重组DNA技术产生了 FVIII。例如，US4，965，199公开了在哺乳动物宿主细胞中产生 治疗量的FVIII的重组产品的方法。也报道过在CHO(中国仓鼠卵巢)细胞和BHKC(幼年 仓鼠肾细胞)中表达人FVIII，并且最近在临床试验中证明了缺失B结构域的FVIII的功效 (US4, 868，112，参考文献 2)。商业上可获得的治疗性FVIII产品包括血清衍生的FVIII(pdFVIII)和重 组 FVIII (rFVIII)产品，例如，全长 rFVIII (Kogenate B ayer, AdVate Baxter， Helixate CSL-Behring)和缺失 B 结构域的 rFVIII ( Refacto Wyeth)。然而，尽管可获得治疗级的FVIII，但对于具有增强特性的FVIII类似物的需求仍 然很高。事实上，以治疗性FVI11 (pdFVII I或rFVI II)来治疗A型血友病患者，15-30 %的情 况下会导致抗FVIII抗体(抑制因子)的出现，该抗FVIII抗体(抑制因子)能中和治疗上 施用的FVIII的促凝血活性(3，4)。抑制因子的出现被认为是对重复施用的外源FVIII蛋 白的异源免疫应答反应。某些血友病患者对外源的重组因子VIII特别敏感，并且产生抗因 子VIII的抗体从而限制了它们的治疗功效。因此，FVIII抑制因子的产生代表主要的医药 障碍和严重的社会关注，因为产生FVIII抑制因子的患者对常规替换治疗产生抵抗。FVIII 抑制因子的出现不仅导致治疗成本增加3倍(5)，而且严重影响患者的生活质量，增加发病 率和死亡率。在这点上，特别需要提供在受试人体中具有减少或缺少的诱导免疫应答的可 能性的FVIII。另外，特别需要提供在受试人体中具有增加的循环时间的FVIII，这对于慢 性疾病和复发疾病(例如A型血友病的情况)特别有利。FVIII指导的特异性免疫应答的第一个步骤是通过抗原呈递细胞(APCs)进行 的FVIII的内吞作用。树突状细胞(DCs)被认为是引发天然T细胞并起始相应的抗原 特异性免疫应答的最有效的APC(6，7)。通过DCs进行的抗原内吞，通常由大胞饮作用 (macropinocytosis)或受体介导的内吞作用来实现。事实上，所述DC表面上存在无数内吞 的受体，其中大部分依赖于二价金属(主要是钙)的存在。许多内吞的受体依赖于它们暴露 的糖类识别结构域(CRDs)对存在于所述抗原(S)上的糖残基是特异性的，被称为C型凝集 素受体(CLRs)。因此，抗原上的甘露糖残基可以被DC表面上的一系列甘露糖敏感性CLRs所 识别，所述甘露糖敏感性CLRs包括甘露糖受体(MR，CD206)、捕获非整合蛋白的树突状细 胞特异性 ICAM3 (DC-SIGN, CD209)、树突状细胞相关 C 型凝集素(dectin)、DEC_205 (CD205)。 甘露聚糖为这些甘露糖敏感性CLRs(尤其是MR和DC-SIGN)的配体(9_11)。DCs上的 DC-SIGN分子使ICAM-3固定在T细胞上。这种特异性相互作用可能在起始DCs和T细胞之间 的免疫突触中起主要作用。因此淋巴细胞的激活可能被阻断性抗DC-SIGN抗体(blocking antibody anti-DC-SIGN)所抑制。几种处理可以减轻FVIII免疫应答的后果。例如使用如下的处理去氨加压素 (desmopressin)(一种合成激素，可以刺激FVIII的产生)、凝固促进剂(例如凝血酶原-复 合体浓缩物或激活的凝血酶原_复合体浓缩物)、重组的VIIa因子、或灌注FVIII以诱导耐 受性。一种新的方法是使用能够与其它抗体的可变区相互作用的抗-独特型抗体，用该 方法来中和所述抑制因子抗体(12)。因此，分离了针对抗-FVIII Cl结构域的化64^单 克隆人本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包括修饰的ＦⅧ多肽的ＦⅧ蛋白，其特征在于，相对于未修饰的相应ＦⅧ多肽，所述修饰的ＦⅧ多肽的相互作用能力或被具有内吞能力的细胞所内吞的能力降低或消失。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：AS什图鲁，S拉克罗伊斯德马兹，S卡韦里，S达斯古普塔，J贝里，
申请(专利权)人：LFB生物科技公司，国家健康与医学研究院，
类型：发明
国别省市：FR[法国]