测量样品中活化因子Ⅶ含量的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测测试样品中活化因子ＶＩＩ含量的方法，包括下列步骤：ａ）将所述测试样品和一种血浆混合，该血浆中缺少因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）且缺少至少一种选自因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）、因子ＩＸ（ＦＩＸ）以及因子ＸＩ（ＦＸＩ）的其它因子，测试样品和血浆的混合物的最终ＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ浓度范围在１０ｐＭ至８０ｐＭ之间；ｂ）添加引发凝血酶生成反应的组分；ｃ）通过对步骤ｂ）的混合物进行凝血酶生成试验（ＴＧＴ）获得凝血酶生成图；ｄ）将步骤ｃ）的凝血酶生成图的至少一个参数与标准凝血酶生成图的相应的参数进行比较，该标准凝血酶生成图是基于标准样品而建立的，标准样品中被活化因子ＶＩＩ的含量是已知的，且每个标准样品之间的被活化因子ＶＩＩ的含量不相同；ｅ）从步骤ｄ）推断出测试样品中活化因子ＶＩＩ含量的测量结果。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种使用一种血浆来测量样品中活化因子VII (FVIIa)的含量的方 法，该血浆缺少FVII以及至少一种选自于因子VIII (FVIII)、因子IX(FIX)和因子XI (FXI) 的其它因子。
技术介绍
血凝固是一种生物体在血管被伤害时控制出血的机理，并因此避免出血。血凝固在一连串步骤之后发生，该系列步骤包括血液中的不同的酶原和辅因子原 (procofactor)经由蛋白水解酶转换成它们的被活化的形式。在该凝固的连续步骤(或连 串步骤)中，有两种不同的路径，即外源性的凝固路径和内源性的凝固路径。两者都导致被 称之为凝血酶原酶的复合体的形成，该凝血酶原酶由被活化的因子X(FXa)、被活化的因子 V(FVa)、磷脂质以及钙所构成。凝血酶原酶将凝血素活化为凝血酶，使得可溶性的纤维蛋白 原转换成形成血块的不溶性的纤维蛋白。外源性路径包括血浆中存在的FVII的介入。然而，后者必须先被活化成FVIIa以 便开始凝固的连串步骤。单独的FVIIa (未与组织因子复合)表现出低的蛋白水解活性。当 FVIIa与组织因子(TF)，一种在血管损害过程中释放的与磷脂质有关的蛋白复合时，这一 活性被增强。FVIIa-TF复合物在钙离子存在的条件下将因子X转换成因子fe。FVIIa-TF 复合物还将FIX转换成FIXa。反过来，因子DCa和)(a将FVII活化为FVIIa。与因子Va和磷脂质复合的因子 Xa(凝血酶原酶)将凝血素转换成凝血酶。凝血酶作用于纤维蛋白原，将其转换成纤维蛋 白，同时还进行其它活动，包括将因子V活化成因子Va，将因子FVIII活化为FVIIIa。在钙 存在的条件下，凝血酶还将因子XIII活化为能巩固纤维蛋白血块的因子Xllla。虽然在外源性凝固路径中，FIX被FVIIa/TF复合体活化成FIXa，在内源性凝固路 径中，FIXa由FXIa从FIX获得，FXIa本身是通过血液与一负电表面例如内皮下层的接触由 因子XII所活化。因此FVIIa，一种依赖于维生素K的糖蛋白，在导致血块形成的凝固机理中起着显 著的作用。在组织被损害引起出血后所释放的组织因子存在的条件下，即使没有因子VIII 或者IX，FVIIa也具有能够在局部起作用的优点。这就是许多年以来FVIIa被用来治疗某 些凝固失调的原因，这些凝固失调本身通过出血而显示出来。第一种方法是从血浆中获得FVIIa。然而，从血浆中制造FVIIa受到供源可获得性 的限制，且血浆的这一用途具有传播病原体的风险，例如传播朊病毒和病毒。这些问题已经 被诺和诺德药业(Novo Nordisk Pharmaceuticals)开发出的重组FVIIa(rFVIIa)所解决， 该重组FVIIa是结构上类似与血浆FVIIa的一种糖蛋白。rFVIIa的主要治疗适应症(在美国、欧洲和日本)涉及具有成熟抗-因子VIII抗 体的A型血友病患者和具有成熟抗-因子IX抗体的B型血友病患者的自发或手术出血的 治疗。在欧洲，其适应症还涉及对具有先天FVII缺陷的病人以及Glanzmarm血小板机能不全病人的用途。此外，许多出版物报道了 rFVIIa对先天凝血因子缺陷或者血小板机能不全病人 在外科手术过程中控制出血的功效。FVIIa的不断增长的广泛用途导致要更新方法以便(1)测量FVIIa的活性(2)确定FVIIa的浓度(3)测量被活化的FVII的含量用于检测FVII活性的最有名的方法是测量凝固时间、PTT(部分凝血活酶时间)、 aPTT (活化部分凝血激酶时间)、TEG (血栓弹性)和TGT (凝血酶生成测试)。这些方法使得 FVIIa活性的检测成为可能，但是迄今为止都不能直接检测样品中被活化的FVII的含量。市场上有用于FVIIa的免疫学检测的商用试剂盒(IMUBIND因子VII酶联免疫试 剂盒)，但是实施该技术的实验条件难于掌握。事实上这种试剂盒使用复杂，具有非常窄的 动态范围、极其有限的线性检测范围，最重要的是需要在4°C的温度下工作。其它用于检测FVIIa浓度的方法在文献中有描述，例如使用被截断了的重组 TF 来测量其蛋白水解活性(Staclot VIIa-rTF, Stago) (US 5，472，850，US 5,741,658， WO 1992/018870，US 5,750,358，US 5,741,658，US 5,472,850，EP 0 641 443)或者测量 FVIIa-抗凝血酶复合体的浓度(W0 03/004694)。然而，这些方法不非常精确且难于实施。 事实上，由于这些方法仅能同时在低FVIIa浓度下处理很少的样品，形成的血栓使得不能 正确的实施该方法。此外，对由FVIIa所产生的FXa的荧光或显色试验也被发现不适合用于测量FVIIa 浓度，因为它们不能将FVII的影响和FVIIa的影响区分开来。一些生物学家所使用的用来评价FVIIa治疗的功效的方法中，血栓弹力图有时候 被用到。该方法包括通过物理分析血栓的形成与时间的关系来测量全部血浆的物理性质。 根据从血栓弹力图中获得的图(称之为thromboelastogramme: )中提取出的参数，临床 医生能评价患者的凝固能力。尽管精确，该方法冗长，不适合日常重复分析，以及其需要在 取血后一个小时内进行因而难于多多样品进行分析。此外，该方法不能测量样品中的被活 化的FVII含量。测量被活化的FVII含量的最有名的方法包括分别测量FVII+FVIIa的浓度以及 FVIIa的浓度，以便从中推断出被活化的FVII含量(FVIIa浓度/FVII+FVIIa浓度的比率)。 尽管FVII+FVIIa浓度测量是准确的，但是直接的FVIIa浓度的测量仍然不精确和难于操作。因此，需要一种可用的方法，其能有效的容易的使用以测量样品中的被活化的 FVII含量，特别是样品中包含未被活化的因子VII和被活化的因子VII时。
技术实现思路
申请人:惊奇的发现使用缺少FVII以及缺少选自FVIII、FIX和FXI的至少一种其 它因子的血浆，使得以一种可靠的、可重复的易于实现的方式测量样品中的被活化的FVII 含量成为可能，特别是测量包含未被活化的因子VII以及被活化的因子VII的样品。在本专利技术的方法中所使用的实验条件因此也使得在样品中的被活化的FVII含量与凝血活酶生成试验(TGT)和获得的凝血酶生成图的某些参数特性之间建立关联成为可 能。这样的关联使得可能通过将所述样品的凝血酶生成图参数与那些从包含已知的 被活化的FVII的含量的组合物中获得的“标准”凝血酶生成图的参数比较而确定被测试样 品中的被活化的FVII含量。因此本专利技术涉及用于测量测试样品中的被活化的因子VII含量的方法，包括如下 步骤a)将所述测试样品和一种血浆混合，该血浆中缺少因子VII (FVII)和缺少至少一 种选自因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)以及因子XI (FXI)的其它因子，测试样品和血浆的 混合物的最终FVII+FVIIa浓度范围在IOpM至80pM之间，b)添加引发凝血酶生成反应的组分；c)通过对步骤b)的混合物进行凝血酶生成试验(TGT)获得凝血酶生成图；d)将步骤C)的凝血酶生成图的至少一个参数与标准凝血酶生成图的相应的参数 进行比较本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测测试样品中被活化的因子Ⅶ的含量的方法，包括下列步骤：　　ａ）将所述测试样品和一种血浆混合，该血浆中缺少因子Ⅶ（ＦⅦ）且缺少至少一种选自因子Ⅷ（ＦⅧ）、因子ＩＸ（ＦＩＸ）以及因子ＸＩ（ＦＸＩ）的其它因子，测试样品和血浆的混合物的最终ＦⅦ＋ＦⅦａ浓度范围在１０ｐＭ至８０ｐＭ之间；　　ｂ）添加引发凝血酶生成反应的组分；　　ｃ）通过对步骤ｂ）的混合物进行凝血酶生成试验（ＴＧＴ）获得凝血酶生成图；　　ｄ）将步骤ｃ）的凝血酶生成图的至少一个参数与标准凝血酶生成图的相应的参数进行比较，该标准凝血酶生成图是基于标准样品而建立的，标准样品中被活化因子Ⅶ的含量是已知的，且每个标准样品之间的被活化因子Ⅶ的含量不相同；　　ｅ）从步骤ｄ）推断出测试样品中的被活化因子Ⅶ含量的测量结果。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：莉西安·希尔伯特，
申请(专利权)人：LFB生物科技公司，
类型：发明
国别省市：FR