具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示序列的ＤＮＡ。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及促进转录因子NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)活化的核因子，具体涉及一种促进NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)活化的人的特异基因、该基因编码的蛋白序列以及它们在制备防治与NF-kappaB活化失调相关疾病的药物等方面的用途。
技术介绍
NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)是一种存在于人体，可在各种类型细胞中广泛表达的转录因子，通常与抑制因子IkappaBs(inhibit kappaB)相结合，以非活性形式存在于细胞质中。NF-kappaB调节大量与细胞应急状态相关的基因的转录，特别是涉及免疫和炎症反应的基因的转录，包括细胞因子(生长因子)、受体、粘附分子、急性期蛋白、病毒基因、转录因子和调节因子等。NF-kappaB在机体免疫应答和炎症反应中发挥重要作用。人类许多病症与NF-kappaB活化的失调直接相关(Barnes et al.，1997)，如癌症、神经退行性疾病、毛细血管扩张共济失调症、类风湿性关节炎、哮喘、肠炎以及大量其它炎症；同时NF-kappaB在某些造血细胞，上皮细胞和淋巴器官结构发育过程中发挥重要作用。近来的研究证明，NF-kappaB家族成员还参与了神经突触的形成和肿瘤的迁移(Karin and Ben-Neriah，2000)。因此NF-kappaB活化途径中的关键因子均可作为药物设计筛选的靶标，调节NF-kappaB活性的因子的研究为免疫及炎症的预防和治疗提供了新的途径。例如最有效的抗哮喘药物肾上腺皮质激素是淋巴细胞中NF-kappaB活力的有效抑制物(Auphan et al.，1995)；美国IMMUNEX公司研发能阻断肿瘤坏死因子TNF诱导NF-kappaB激活的药物Enbrel用于治疗类风湿性关节炎。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种促进NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)活化的cDNA序列，以及该基因编码的蛋白，为干预NF-kappaB的活化提供药物设计靶标。本专利技术利用酵母双杂交筛选获得了促进NF-kappaB活化的新的调节因子。本专利技术发现了具有SEQ ID NO1所示序列的cDNA，命名为NKAP(NuclearNF-kappaB Activating Protein)。实验结果证明，NKAP基因及其编码的NKAP蛋白(具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列)是促进NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)活化的调节因子。上述NKAP基因和蛋白是用已知在TNF-R1诱导的NF-kappaB活化过程中发挥重要作用的激酶RIP作为钓饵，用酵母双杂交方法筛选与之相互作用的蛋白而得到的。序列分析表明，NKAP与已知基因没有明显的序列同源性并在各物种间序列保守。在293细胞中过量表达NKAP能够剂量依赖性地活化NF-kappaB。反义RNA实验进一步证明，NKAP表达量的下降能够抑制NF-kappaB的活化，并使TNF和IL-1诱导NF-kappaB激活的能力明显降低。免疫荧光染色的实验结果表明NKAP定位于细胞核内。以上实验结果证明，NKAP是TNF和IL-1激活NF-kappaB信号途径中一种新的调节因子。因为能够对NF-kappaB活性起调节作用的蛋白可作为潜在的蛋白药物直接调节NF-kappaB的活性，或者作为药物设计的靶标，药物通过调节其的活性间接调节NF-kappaB的活化。本专利技术提供的NKAP基因和蛋白可以调控NF-kappaB的活化，因此可以为干预NF-kappaB活化的药物筛选的分子提供设计靶标及炎症的诊断标记。与各种药物可接受的赋形剂、药物辅剂配伍后，可以将NKAP基因和蛋白全长分子或片段直接作为蛋白药物制成各种类型的药物，增加NF-kappaB的活性；或者针对NKAP设计抑制药物，通过抑制NKAP来降低NF-kappaB的活性。用于预防或治疗与NF-kappaB活化的失调相关的疾病。附图说明图1是NKAP对NF-kappaB及NKAP对转录因子AP-1的效应的荧光报告基因检测对比结果。图中可看出，NKAP能够活化NF-kappaB，而对AP-1的活性没有影响。图2是NKAP反义RNA稳定表达细胞系与对照细胞系的荧光报告基因测试结果。图中显示NKAP表达量的下降能够抑制NF-kappaB的活化。具体实施例方式一.材料人胚肾293细胞购自ATCC；细胞培养用DMEM，胎牛血清，0.05％胰酶溶液，丙酮酸钠溶液，青、链酶素溶液购自GIBCO和Hyclone； 酵母培养用Peptone购自Difco，添加剂CSM-Trp-，CSM-Trp-Leu-，CSM-His-Leu-Trp-购自Q-BIO Gene；鲑精DNA购自Roche；哺乳动物细胞表达载体pRK-HA由本实验室构建；NF-kappaB荧光报告质粒由Dr.Gary Johnson(University of Colorado Health ScienceCenter)惠赠；pRL-SV40 Renilla荧光报告质粒购于Promega；酵母双杂交“钓饵”载体pGBT9购自CLONTECH；人B细胞cDNA文库购自ATCC；大肠杆菌表达载体PET-15b，大肠杆菌BL21(DE3)菌株及镍离子柱纯化试剂盒购自Novagen；含有NKAP部分编码序列的EST克隆BG391661购自ATCC，用于构建NKAP反义RNA的载体pIRESneo3购自CLONTECH；载体构建所需限制性内切酶购自Promega；DNA回收试剂盒Geneclean III Kit购自Q-BIO Gene；DNA序列测定由中国上海生工生物工程公司完成；PCR引物由中国上海生工生物工程公司合成；双荧光报告基因检测试剂盒购自Promega；免疫共沉淀所用磁珠Protein G-Sepharose购自Amersham Biosciences；Western blot用硝酸纤维素膜Hybond ECL和HRP偶联的羊抗鼠IgG、羊抗鼠兔IgG购自Amersham pharmacia biotech.；化学发光底物试剂盒购自PIERCE；重组的人TNF，IL-1购自R&D Systems Inc.；HA单克隆抗体购自Sigma；兔抗人NKAP蛋白的多克隆抗体由中科院遗传所免疫室制备；TXRD偶联的羊抗鼠IgG，FITC偶联的羊抗兔IgG，DAPI购自Southern BiotechnologyAssociates Inc.；防淬灭封片剂Gel/mountTM购自Biomeda Corp.；CaCl2，PEG4000，LiAc，DMSO购自Sigma；CsCl购自Fisher Biotech.；β-gal购自Promega；其它化学试剂购自北京化学试剂商店。二.方法1.质粒构建及DNA纯化从293细胞cDNA文库中PCR得到RIP全长分子，构建到酵母双杂交用，编码转录因子Gal4结合结构域的载体pGBT9，得到可在酵母细胞中表达的质粒pGBT9-RIP；GeneBank检索及EST(expression sequece tag)序列拼接得到NKAP分子的全长编码序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈丹英，舒红兵，翟中和，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：
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